水稻Xoo诱导表达基因Xig1的克隆与功能分析

发布时间：2020-09-30 02:01

　　由水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的水稻白叶枯病(Bacterial blight,BB)是世界上分布最广、危害最严重的水稻细菌性病害之一,严重影响着水稻产量和稻米品质。多年的科学研究与生产实践证明,种植抗病品种是控制水稻白叶枯病最经济、最有效的措施。序列特异性核酸酶(Sequence-specific nucleases,SSNs)介导的基因组编辑技术是近年发展起来的作物性状改良策略,而CRISPR/Cas9系统被认为是SSNs最便捷、有效的编辑方法。本研究利用CRSIPR/Cas9系统多靶点编辑水稻功能未知基因Xig1(Xoo induced gene,Xig),以提高水稻白叶枯病抗性并进行基因功能研究,获得的主要结果如下:1.通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)对感白叶枯病籼稻品种IR24和野生稻基因导入系W6023中的Os11g39100基因进行相对表达量的分析以验证实验室前期结果,相对表达量分析显示该基因在IR24中表达量较高,而在W6023中几乎不表达,且该基因在IR24中受病原菌诱导表达。此结果与实验室前期RNA-Seq结果一致,将此基因暂时命名为Xig1。2.利用PCR方法克隆了Xig1基因,IR24和W6023中Xig1基因的DNA序列长度均为612bp,仅含一个外显子。在核苷酸序列上存在3个SNPs,氨基酸序列上导致2个氨基酸替换。IR24中该基因的启动子区与籼稻材料蜀恢498的相应序列完全一致,并对启动子区的顺式作用元件进行了分析。3.利用烟草瞬时表达系统观察到融合有荧光蛋白的XIG1位于细胞膜和细胞核上,同时表明Xig1在植物细胞中是可表达的。4.构建靶向IR24中Xig1的三靶点CRISPR/Cas9载体,共得到T_0代转基因阳性植株31株。经过自交和分子鉴定,获得目标基因修饰的T_2代基因编辑纯合株系17个。筛选到其中8个T-DNA free株系,在T_3代进行了白叶枯病的接种鉴定;结果显示,与成株期野生型相比,8个株系在接种后1周和2周的病斑长度明显缩短,缩短长度在40%-50%。上述8个株系的主要农艺性与野生型相比均没用明显的差异。综上所述,本研究克隆到一个白叶枯病感病相关基因,并获得了8个水稻白叶枯病抗性显著提高的抗病资源材料。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S435.111.47
【部分图文】：

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院硕士学位论文 Kandavelou et al, 2009），利用不同的锌指结构识别特异 DNA 序列，再2005 年，Urnov 等发现了一对由 4 个锌指连接而成的 ZFNs，这对 ZFN序列，由此科学家展开了 ZFN 在基因组编辑中的应用（Urnov et al, 20一般包含 3-4 个锌指（Zinc finger, ZF）结构，可以特异识别 9-12bp 的基因组进行编辑需要 ZFN 单元形成二聚体才能产生 DNA 双链断裂（K域为核酸内切酶 FokⅠ的切割结构域（Urnov et al, 2010）。ZFN 技术意图如图 1 所示。FN 已应用于果蝇（Wang et al, 2012）、人类干细胞（Bao et al, 2014. 猪（Yu et al, 2011）、牛（Menoret et al, 2010）、大鼠（Zhang et al, 2l, 2005）、拟南芥（Curtin et al, 2011）、大豆（Bonas et al, 1989）等生由于 ZFN 的构建难度比较大、成本高、耗时长、筛选效率低等不足，发展这项技术在生物学研究中日渐被取代。

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图 2. TALEN 靶向切割 DNA 示意图（周想春等，2016）Fig. 2 Principle of TALEN cleave DNA（周想春等，2016）CRISPR 技术简介87 年 CRISPR 最早被日本大阪的研究人员发现于大肠杆菌基因组中（Ishino et al直到 2002 年国际上才将这种不同寻常的 DNA 片段被正式命名为 CRISPR（JanCRISPR/Cas 系统是存在于细菌和古细菌中的一种适应性免疫系统，能够特异性的 DNA 片段并将其敲除，以保证自身遗传物质的保守性。CRISPR 表示成簇的规文重复序列，Cas 则是一种和 CRISPR 系统相关联的蛋白质，其作用是特异的识进行靶向切割。当这类细菌或古细菌被外源 DNA 入侵时，CRISPR 系统能够捕一段特定的核苷酸序列，并将这段核苷酸序列整合到 CRISPR 系统的重复序列的当此外源 DNA 再次入侵时，CRISPR 系统就会在该位点产生一种与入侵基因组特的 crRNA（CRISPR-derived RNA），在 crRNA 的引导下 Cas 蛋白会靶向切割外源达到抵御外源 DNA 入侵的目的（Ishino et al, 1987）。CRISPR/Cas 系统有 3 种类型和 III 型（Makarova et al, 2011. Reeks et al, 2013）。I 型和 III 型系统较为复杂蛋白形成复合体来切割 DNA 双链。而目前应用最为广泛的 II 型的 CRISPR/Cas 系 Cas9 蛋白核酸酶就能实现对 DNA 双链的切割（Chylinski et al, 2014）。

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图 3. CRISPR/Cas9 系统靶向切割 DNA 示意图（周想春等，2016）Fig. 3 Principle of CRISPR/Cas9 system cleave DNA（周想春等，2016）1.2.3 CRISPR 技术的优势CRISPR 技术自问世以来，就在生命科学界掀起热潮，由于其精确度高、成本低的优势 CRISPR 的踪迹几乎遍布了世界各生命科学实验室。作为一项先进且普及的术，CRISPR 技术已连续三次入选 Science 杂志年度十大突破，该杂志认为以 CRIS基因编辑技术，势必对生命科学的研究产生革命性影响。与 ZFN、TALEN 等基因

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