海藻糖合酶基因的克

发布时间：2020-09-30 11:47

　　 海藻糖因其稳定性好和对生物大分子具有非特异性保护作用等特点,近年来在食品、医药、农业等行业中被广泛使用。目前,工业上海藻糖的生产方法主要包括化学合成法、微生物发酵法、微生物抽提法、酶转化法和转基因法等。在酶转化法中,海藻糖合酶能一步催化麦芽糖生成海藻糖,由于具有工艺流程短、易调控、生产原料低廉等优点,从而在工业生产中具有较高的开发应用价值。本文将一种来源于60℃、pH0.7环境中的耐热嗜酸古菌(Picrophilus torridus)的海藻糖合酶基因分别在大肠杆菌和毕赤酵母中进行克隆表达,并探索了一种快速简单高效的海藻糖合酶固定化方法。主要研究工作如下:1.依照大肠杆菌密码子偏好性,将海藻糖合酶基因(GenBank:AE017261)进行优化,合成了一段基因大小为1677 bp的海藻糖合酶(TreS)片段。在两端设计的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点双酶切后,连接至pET-28a(+)载体上,构建得表达质粒pET-28a(+)-TreS,并转化在大肠杆菌BL21,得到大肠杆菌工程菌株。该工程菌诱导表达重组蛋白的分子量约为65 kDa,诱导剂IPTG的最适添加量0.1 mmol/L,最适诱导温度20℃,最适诱导时间12 h;薄层色谱(TLC)结果说明重组菌株经诱导后的粗酶液具有催化麦芽糖生成海藻糖的酶活性;将粗酶液纯化后,高效液相色谱(HPLC)结果进一步说明纯化酶也具有催化麦芽糖生成海藻糖的能力。2.为研究不同表达系统对产物表达水平的影响,利用Gibson法将该海藻糖合酶片段连接到质粒pPICZαA的EcoRⅠ位点上,构建表达载体pPICZαA-TreS,同源重组到毕赤酵母GS115基因组中,筛选出高拷贝菌株后,利用甲醇进行诱导表达,TLC结果表明在毕赤酵母胞内和胞外都检测到海藻糖合酶活性。3.利用壳聚糖作为载体,对大肠杆菌表达纯化后的海藻糖合酶进行固定化。单因素试验结果表明,最适海藻糖合酶加入量为32 mg/g(壳聚糖),最适吸附时间为2.5 h;经过9次重复试验,固定化酶酶活残留率为64.64%;与游离酶相比,固定化酶温度稳定性没有明显变化,但酸碱稳定性优于游离酶;反应进程试验结果表明,该固定化酶在反应2 h时,海藻糖得率达最大61.4%。
【学位单位】：湖北工业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q78;Q814
【部分图文】：

1 The biosynthetic pathway of intracellular trahalose in SaccharcerevisiaeTreY-TreZ 途径：该途径由麦芽寡糖基海藻糖合成酶（MTS麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase，TreZ 基因编码）共同 MTSase 的催化下，麦芽糊精末端两分子葡萄糖之间的糖苷为 α,α-1,1 糖苷键，使麦芽糊精成为麦芽寡糖基海藻糖；再麦芽寡糖基海藻糖被水解为麦芽糊精（减少了两个葡萄糖基藻糖，该途径已在节杆菌、根瘤菌、硫磺矿硫化叶菌及结反应式如图 1.2 所示。图 1.2 TreY-TreZ 海藻糖合成途径ig. 1.2 The intracellular trahalose synthesis pathway of TreY-Tr

图 1.1 酿酒酵母中胞内海藻糖合成途径 The biosynthetic pathway of intracellular trahalose in SaccharcerevisiaeeY-TreZ 途径：该途径由麦芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSa芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase，TreZ 基因编码）共同TSase 的催化下，麦芽糊精末端两分子葡萄糖之间的糖苷 α,α-1,1 糖苷键，使麦芽糊精成为麦芽寡糖基海藻糖；再芽寡糖基海藻糖被水解为麦芽糊精（减少了两个葡萄糖基糖，该途径已在节杆菌、根瘤菌、硫磺矿硫化叶菌及结反应式如图 1.2 所示。

固定化酶1953 年德国的 GRUBHOFER N 等首次提出固定化酶概念。它是一种经物方法处理，限制在一定的空间范围内，可以反复使用而又能发挥催化作剂。许多研究已经证明，固定是改善酶特性的有效方法，如稳定性、活性、特异性和降低抑制[54]。同自由酶相比，固定化酶具有以下优点：稳酶可反复使用；极易与底物和产物分开，产物纯度高；反应条件易于控小型化，可节约能源；可连续化和自动化生产，节约劳动力等。在 196的TOSAT等首次在工业生产中应用固定化氨基酰化酶以DL-氨基酸为底产 L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革，这是固定化酶从实验室研工业化生产的重大转折，此后固定化酶的研究得到了飞速的发展[55]。酶的固定化技术主要包括交联、吸附、包埋和共价结合（化学偶联）[5法（图 1.3 列举了部分酶的固定化技术）。

【参考文献】

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本文编号：2830802