miR-125a-3p及其靶基因PTB在轮状病毒复制调控中的作用机制研究

发布时间：2020-09-30 15:59

　　 轮状病毒(Rotavirus,RV)是一种无包膜的二十面体形状的双链RNA病毒,是引起五岁以下婴幼儿腹泻的主要病原体。有关RV感染细胞后的复制机制尚不十分清楚。有研究表明,病毒在宿主细胞中的复制与细胞代谢的某些环节相关,其中细胞miRNAs表达水平是主要因素。miRNAs是一类长度约为22个碱基的非编码小RNA分子,其作用可调节细胞代谢过程过程中的转录,进而影响细胞分裂过程。病毒也许正是通过改变细胞miRNAs的表达,操控宿主细胞蛋白水平的表达,达到促进自身复制的目的。RV感染后是否引起细胞miRNAs表达的改变,miRNAs作用的靶点是什么,通过什么途径进行调控以影响RV的复制。在我们的前期研究中发现RV感染细胞后,宿主细胞miR-125a-3p表达水平下调,并且miR-125a-3p与RV的作用关系尚不明确,针对这一现象展开了较深入的研究。本论文研究目的探讨miR-125a-3p在RV感染细胞后下调的真实性,寻找该分子的作用靶点,相互作用机制及在RV复制过程中的作用关系。研究方法:用RV毒株(ZTR-68)G1P[8]型(源于流行地区的致病毒株)感染MA104细胞(恒河猴肾细胞,对RV敏感)后,检测宿细胞miRNAs的表达谱,深度测序确定表达差异的miRNA分子。用miRanda软件进行比较预测寻找miRNAs可能作用靶点。经双荧光素酶报告系统验证miRNA分子与其靶基因的关系,进一步利用体外转染该分子模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitor)评价下游靶基因的表达。RT-qPCR、免疫荧光等方法检测靶基因的表达,以及通过上下调靶基因检测RV的复制情况。用免疫共沉淀法探测了靶基因与RV相互作用关系的结合位点。研究结果:RV感染MA104细胞后,miRNAs有表达差异,深度测序表示:该差异分子为miR-125a-3p,且miR-125a-3p能够抑制RV的复制;miRanda预测提示多聚嘧啶结合蛋白(PTB)是该分子的可能靶点。双荧光素酶报告系统证实二者存在靶定关系,经过表达和抑制表达miR-125a-3p发现,miR-125a-3p能下调PTB的表达;PTB在感染早期定位于胞核,后期迁移出至胞质。通过调节PTB的表达试验证实,PTB能促进RV复制。经免疫共沉淀试验明确了 PTB作用于RV非结构蛋白NSP3,二者协同促进病毒的复制。结论:miR-125a-3p是宿主细胞抗病毒复制的主要因素,对病毒复制起到抑制作用。RV感染细胞后,通过下调宿主细胞miR-125a-3p表达,解除对靶基因PTB的抑制,影响宿主细胞蛋白翻译以促进病毒自身蛋白的翻译,装配形成完整的子代病毒。该研究结果有助于了解揭示RV感染细胞复制机理,也可为寻找抗RV药物靶点提供线索。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R373
【部分图文】：

胞和乳腺癌细胞ＭＣＦ－７中呈现高表达情况，在疫苗生产用Ｖｅｒｏ细胞中ＰＴＢ表达水逡逑平也很高，但在ＫＭＢ１７细胞和人脐带间充质干细胞中表达水平很低，在大鼠的神逡逑经干细胞中不表达ＰＴＢ邋（图１）。逡逑７逡逑

相应病毒蛋白的表达，说明ＭＡ１０４细胞和ＫＭＢ１７细胞表面均具有ＲＶ感染的必须逡逑受体。但在病毒感染１６ｈ后，ＫＭＢ１７细胞中检测到的轮状病毒蛋白表达量与ＭＡ１０４逡逑细胞和Ｖｅｒｏ细胞中的病毒蛋白表达量有明显差异（图２）。将野毒株ＺＴＲ－６８感染逡逑ＭＡ１０４细胞和ＫＭＢ１７细胞后进行连续传代，ＺＴＲ－６８株无法适应生长于ＫＭＢ１７细逡逑胞。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ结果表明，ＰＴＢ在ＭＡ１０４细胞和Ｖｅｒｏ细胞中高表达，而在ＫＭＢ１７逡逑细胞中表达水平很低（图３）。这一结果提示我们，ＰＴＢ可能与轮状病毒在不同宿主逡逑细胞中的感染敏感性有很强的相关性，对轮状病毒的复制和增殖起到促进作用。逡逑ｓｓＨＩＩＢＨ逡逑ＥＨｈＢＨｈ逦＾逡逑■■逡逑图２轮状病毒ＺＴＲ－６８感染ＭＡ１０４邋（Ａ、Ｂ）和ＫＭＢ１７邋（Ｃ、Ｄ）细胞１６ｈ后检测病毒蛋逡逑白逡逑Ｈｅｌａ邋ＭＡ１０４逦ＭＡ１０４邋ＫＭＢ１７邋ＫＭＢ１７逡逑Ｐ３５逦Ｐ４０逦Ｐ４０逦Ｐ５０逡逑图３邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测ＰＴＢ在ＭＡ１０４和ＫＭＢ邋１７细胞中的表达量逡逑通过免疫荧光检测感染ＥＶ７１，ＣＡ１６，腺病毒及轮状病毒后ＰＴＢ蛋白的表达及逡逑８逡逑

ＭＡ１０４细胞和ＫＭＢ１７细胞后进行连续传代，ＺＴＲ－６８株无法适应生长于ＫＭＢ１７细逡逑胞。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ结果表明，ＰＴＢ在ＭＡ１０４细胞和Ｖｅｒｏ细胞中高表达，而在ＫＭＢ１７逡逑细胞中表达水平很低（图３）。这一结果提示我们，ＰＴＢ可能与轮状病毒在不同宿主逡逑细胞中的感染敏感性有很强的相关性，对轮状病毒的复制和增殖起到促进作用。逡逑ｓｓＨＩＩＢＨ逡逑ＥＨｈＢＨｈ逦＾逡逑■■逡逑图２轮状病毒ＺＴＲ－６８感染ＭＡ１０４邋（Ａ、Ｂ）和ＫＭＢ１７邋（Ｃ、Ｄ）细胞１６ｈ后检测病毒蛋逡逑白逡逑Ｈｅｌａ邋ＭＡ１０４逦ＭＡ１０４邋ＫＭＢ１７邋ＫＭＢ１７逡逑Ｐ３５逦Ｐ４０逦Ｐ４０逦Ｐ５０逡逑图３邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测ＰＴＢ在ＭＡ１０４和ＫＭＢ邋１７细胞中的表达量逡逑通过免疫荧光检测感染ＥＶ７１，ＣＡ１６，腺病毒及轮状病毒后ＰＴＢ蛋白的表达及逡逑８逡逑

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