MdFD基因的功能验证及苹果早花相关基因的表达分析

发布时间：2020-10-08 22:14

　　开花是种子植物生活史中最重要的事件之一。以往的研究表明,植物成花调控的关键基因相对保守,过量表达一年生草本或多年生木本来源的开花素基因Flowering Locus T(FT)及与之互作的b ZIP家族转录因子基因Flowering Locus D(FD)等成花促进基因均能够使转基因植株提早开花。作为研究多年生木本植物,苹果中的Md FT1/2基因的早花功能早在2010年就已被鉴定,但对于Md FD基因至今尚无报道。本研究通过生物信息学分析、表达分析、转基因植物表型鉴定、酵母双杂交和双分子荧光互补等方法对苹果Md FD基因的功能及其与Md FT1的相互作用进行了初步研究,并以山定子与早花山定子为试材,对重要的开花调节相关基因的表达及其启动子差异进行了分析。主要结果如下:1.利用DNAMAN、MAGE等在线分析软件对Md FD基因进行生物信息学分析,发现Md FD与枇杷中FD同源基因亲缘关系最近,开放阅读框为840 bp,包含3个外显子和2个内含子,编码279个氨基酸残基,其蛋白的分子量为30.207 k Da,等电点10.01,为亲水性蛋白质。利用在线分析软件Plant CARE对Md FD基因启动子序列进行分析,结果显示该基因启动子序列中含有光响应元件、昼夜节律调控元件、ABA、生长素及Me JA等植物激素响应元件。2.利用荧光定量PCR对Md FD基因的季节性表达特征进行分析,发现MdFD基因存在两个表达高峰,分别出现在九月和次年一月份,在四月份和五月份表达量低。3.构建了MdFD基因过表达载体,农杆菌介导遗传转化野生型拟南芥和fd突变体,对MdFD基因的功能进行鉴定。结果显示与对照植株相比,转基因拟南芥能够早花。构建酵母双杂交表达载体及双分子荧光互补表达载体,对Md FD与Md FT1的相互作用进行分析。酵母双杂交分析显示,Md FD蛋白具有自主激活活性,自身能形成同源二聚体,Md FD与MdFT1蛋白互作;双分子荧光互补显示,在植物体内MdFD与MdFT1蛋白互作。4.对不同开花相关基因进行表达特征分析显示,早花山定子中Mb FD、Mb FT1、Mb AP1等多个重要开花相关基因的表达均高于山定子;对两份资源启动子序列进行比较发现,山定子和早花山定子Mb AP1基因启动子序列上的顺式作用元件存在差异。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S661.1
【部分图文】：

序列,基因结构,对比分析

2.1.10.2 MdFD 基因表达分析依据 MdFD 序列，设计定量引物，以 AtQub 作为内参基因，采用三步法进行荧光定量 PCR分析，方法同上。2.2 结果与分析2.2.1 MdFD 基因克隆及生物信息学分析2.2.1.1 MdFD 基因结构分析及克隆根据已知的拟南芥 AtFD 基因序列，通过在线分析软件 NCBI 进行 Blast，筛选得到苹果 FD同源基因 MdFD 基因序列，根据其序列设计引物，以‘嘎啦’苹果茎尖分生组织 cDNA 为模板扩增 MdFD 基因。经 DNAMAN 分析结果显示，MdFD 开放阅读框为 840 bp，编码 279 个氨基酸残基，其蛋白的分子量为 30.207 kDa，等电点 10.01，为亲水性蛋白质。通过在苹果基因组上进行比对，结果显示 MdFD 定位到第 15 号染色体上，对其基因组结构进行分析，发现苹果 FD 同源基因 MdFD 与拟南芥 FD 基因结构一样，都含有 3 个外显子和 2 个内含子（图 2-1）。

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【参考文献】