毛果杨PtrNAC1基因的克隆及在低氮环境下的响应
发布时间：2020-10-08 23:14
在杨树中,通过对转录组数据的分析,反映出某些基因对杨树侧根的生长起到了促进作用,我们通过建立一个遗传网络包含了大比例的差异调节转录,其中只有三个基因的转录对根系发育有强烈的影响,在低氮条件下,上下调节这三个基因分别引起根的增加和减少,转录因子PtrNAC1就是其中之一。本实验先对PtrNAC1基因进行了生物信息学分析,预测毛果杨NAC蛋白在氨基酸序列12-137位有一个结构域,并且该结构域保守。我们从毛果杨根部的全基因组中克隆了PtrNAC 基因,并构建了植物表达载体pROKII-PtrNAC1,分别进行烟草和84K杨的遗传转化并分别获得了抗性植株,以此为材料,我们进行低氮处理,分别设置了0、5mMNH4Cl、10mM NH4Cl、5mMNaNO3、10mMNaNO3 处理液,对处理后的非转基因株系与转基因株系分别进行叶绿素含量、氮含量及生理生化指标的测定,得出结论:(1)PtrAC1基因全长918bp,蛋白氨基酸残基数为305,相对分子质量34655.33,等电点PI为6.71,呈酸性,为不稳定蛋白,疏水性蛋白,通过分析预测其存在一个保守结构域NAC。(2)构建pROKⅡ-PtrNAC1植物表达载体,利用农杆菌介导法进行烟草遗传转化并获得抗性植株,选取基因表达量高、中、低三个转基因株系对其进行低氮处理,并对其叶片进行生理生化指标(POD、SOD、MDA)的测定。结果表明:在低氮处理下,转基因烟草优于非转基因烟草,其中高表达量的L1差异显著。(3)利用农杆菌介导法进行84K杨遗传转化并获得抗性植株,选取基因表达量高、中、低三个转基因株系进行低氮处理,并对其叶片进行叶绿素含量测定,对其叶片与根进行硝态氮、铵态氮与生理生化指标的测定。结果表明:在低氮处理下,转基因84K杨的叶绿素含量、硝态氮、铵态氮含量均高于非转基因84K杨,生理生化测定结果显示转基因84K杨优于非转基因84K杨,其中高表达量的L1差异显著。
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S792.11
【部分图文】：
图２－１毛果杨ＲＮＡ提取及毛果杨Ｐ／ｒＡＭＣ７基因克隆的结果逡逑毛果杨总邋ＲＮＡ邋提取．Ｍ：邋ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ５０００；邋１－２：毛果杨总邋ＲＮＡ；逡逑毛果杨Ｐ／／ＷＪＣ／基因克隆．Ｍ：邋ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ５０００；邋１：毛果杨Ｐ／／ＷＪＣ７ＰＣＲ产物；逡逑ＡＳＹ－ＴＨ／ｒＡ＾ａ菌液ＰＣＲ检测结果逡逑，ｉｓｓ逡逑图邋２－２邋ｐＥＡＳＹ－Ｔｌ－ｉＶ＿Ｍ４Ｃ７邋菌液邋ＰＣＲ邋检测结果逡逑ＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ邋ＤＬ５０００；邋１－８：邋ｐＥＡＳＹ－Ｔｌ－ＰｔｒＮＡＣｌ邋菌液邋ＰＣＲ邋产物；逡逑一
２．４．５毛果杨进化树的构建逡逑利用ＭＥＧＡ７．０软件对毛果杨基因的氨基酸序列进行系统进化树的构建，使用逡逑邻接法Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ邋（ＮＪ）预测系统发生树，见图２－５，结果显示，毛果杨ＰｔｒＮＡＣｌ与逡逑胡杨（７＾界／ｚｗｗｐ／ｚｒａ／ｔｏ／）的ＮＡＣ－２１／２２－ｌｉｋｅ在进化关系上更近一钱。逡逑５１］逦Ｒｉｃｉｎｕｓ邋ｃｏｍｍｕｎｉｓ逡逑９９逦逦Ｊａｔｒｏｐｈａ邋ｃｕｒｃａｓ逡逑２0逦逦Ｈｅｖｅａ邋ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ逡逑——Ｐｏｐｏｌｕｓ邋ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ逡逑４３逦ｉ00逡逑逦逦逦Ｐｏｐｕｌｕｓ邋ｅｕｐｈｒａｔｉｃａ逡逑逦Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ邋ｃａｃａｏ逡逑４０逦Ｊｕｇｌａｎｓ邋ｒｅｇｉａ逡逑逦Ｇｌｙｃｉｎｅ邋ｍａｘ逡逑１００逦Ｃａｊａｎｕｓ邋ｃａｊａｎ逡逑逦Ｃａｍｅｌｌｉａ邋ｓｉｎｅｎｓｉｓ逡逑Ｉ逦１逡逑０．０５０逡逑图２－５毛果杨ＰｔｒＮＡＣｌ蛋白的系统进化树分析逡逑从上至下分别为：蓖麻、麻风树、橡胶树、毛果杨、胡杨、可可树、胡桃、大豆、木豆、茶逡逑树逡逑２．５本章小结逡逑本实验通过对毛果杨根部总ＲＮＡ提取，反转录为ｃＤＮＡ为模板，用表２－２中的特异性逡逑弓丨物进行ＰＣＲ扩增，获得毛果杨基因片段。逡逑毛果杨基因全长９１８ｂｐ，蛋白氨基酸残基数为３０５，相对分子质量３４６５５．３３，逡逑等电点ＰＩ为６．７１，呈酸性，为不稳定蛋白，疏水性蛋白。通过分析工具Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋Ｄｏｍａｉｎ逡逑Ｓｅａｒｃｈ邋Ｓｅｒｖｉｃｅ邋（ＣＤＳｅａｒｃｈ）预测毛果杨蛋白的结构域的氨基酸序列在１２－１３７位处
的重组质粒转化到农杆菌ＧＶ３１０１中，随机挑取培养基上的单克隆，进行质粒ＰＣＲ验逡逑证。ＰＣＲ结果显示，ＰＣＲ产物条带大小与目的条带大小一致，因此确定ｐＲＯＫｌＩ－逡逑重组质粒成功转化到农杆菌ＧＶ３１０１中（图３－１）。逡逑图邋３－１邋ｐＲＯＫＨ－ＰａＡ＾Ｃｉ邋菌液邋ＰＣＲ邋结果逡逑Ｍ：邋ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ５０００；邋１－８：邋ｐＲＯＫｌＩ－尸菌液邋ＰＣＲ邋产物；逡逑３．３．２毛果杨转基因烟草抗性植株的获得及鉴定逡逑３．３．２．１毛果杨转基因烟草抗性植株获得逡逑通过农杆菌介导法进行烟草的遗传转化，培养在含有４５ｍｇ／Ｌ邋Ｋａｎ的ＭＳ分化培养逡逑基中（图３－２－Ａ），获得抗性愈伤，培养一段时间后，转到含有５０ｍｇ／ＬＫａｎ的ＭＳ分化逡逑培养基中（图３－２－Ｂ），获得抗性芽，移至ＭＳ生根培养基中进行生根（图３－２－Ｃ）。逡逑图３－２毛果杨ＡｒＡ＾ＩＣ／转勵Ｎ烟草的获得逡逑Ａ：毛果杨转基因烟草抗性愈伤；Ｂ：毛果杨Ｐ／ｒＡ６４Ｃ／转基因烟草抗性芽；逡逑Ｃ：毛果杨尸／ＭＭＣ？转基因烟草抗性植株逡逑３．３．２．２毛果杨竹R嚕茫纷蜓滩菘剐灾仓甑募ㄥ义希保睿校颍睿郑剩茫蜓滩菘剐灾仓甑募ㄥ义咸崛》亲蜓滩莺退凶蜓滩菀镀埽模危粒⒆魑０澹穑遥希耍桑桑义希疲椅铮镄蛄屑恚常担校校茫壹觳猓校茫姨逑导恚常叮澹校茫页绦蚣恚常义希罚耘└司柿Ｗ魑粜远哉眨亲蚝退魑跣远哉眨校茫医峁允荆铄义希玻埃义
本文编号：2832890
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S792.11
【部分图文】：
图２－１毛果杨ＲＮＡ提取及毛果杨Ｐ／ｒＡＭＣ７基因克隆的结果逡逑毛果杨总邋ＲＮＡ邋提取．Ｍ：邋ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ５０００；邋１－２：毛果杨总邋ＲＮＡ；逡逑毛果杨Ｐ／／ＷＪＣ／基因克隆．Ｍ：邋ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ５０００；邋１：毛果杨Ｐ／／ＷＪＣ７ＰＣＲ产物；逡逑ＡＳＹ－ＴＨ／ｒＡ＾ａ菌液ＰＣＲ检测结果逡逑，ｉｓｓ逡逑图邋２－２邋ｐＥＡＳＹ－Ｔｌ－ｉＶ＿Ｍ４Ｃ７邋菌液邋ＰＣＲ邋检测结果逡逑ＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ邋ＤＬ５０００；邋１－８：邋ｐＥＡＳＹ－Ｔｌ－ＰｔｒＮＡＣｌ邋菌液邋ＰＣＲ邋产物；逡逑一
２．４．５毛果杨进化树的构建逡逑利用ＭＥＧＡ７．０软件对毛果杨基因的氨基酸序列进行系统进化树的构建，使用逡逑邻接法Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ邋（ＮＪ）预测系统发生树，见图２－５，结果显示，毛果杨ＰｔｒＮＡＣｌ与逡逑胡杨（７＾界／ｚｗｗｐ／ｚｒａ／ｔｏ／）的ＮＡＣ－２１／２２－ｌｉｋｅ在进化关系上更近一钱。逡逑５１］逦Ｒｉｃｉｎｕｓ邋ｃｏｍｍｕｎｉｓ逡逑９９逦逦Ｊａｔｒｏｐｈａ邋ｃｕｒｃａｓ逡逑２0逦逦Ｈｅｖｅａ邋ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ逡逑——Ｐｏｐｏｌｕｓ邋ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ逡逑４３逦ｉ00逡逑逦逦逦Ｐｏｐｕｌｕｓ邋ｅｕｐｈｒａｔｉｃａ逡逑逦Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ邋ｃａｃａｏ逡逑４０逦Ｊｕｇｌａｎｓ邋ｒｅｇｉａ逡逑逦Ｇｌｙｃｉｎｅ邋ｍａｘ逡逑１００逦Ｃａｊａｎｕｓ邋ｃａｊａｎ逡逑逦Ｃａｍｅｌｌｉａ邋ｓｉｎｅｎｓｉｓ逡逑Ｉ逦１逡逑０．０５０逡逑图２－５毛果杨ＰｔｒＮＡＣｌ蛋白的系统进化树分析逡逑从上至下分别为：蓖麻、麻风树、橡胶树、毛果杨、胡杨、可可树、胡桃、大豆、木豆、茶逡逑树逡逑２．５本章小结逡逑本实验通过对毛果杨根部总ＲＮＡ提取，反转录为ｃＤＮＡ为模板，用表２－２中的特异性逡逑弓丨物进行ＰＣＲ扩增，获得毛果杨基因片段。逡逑毛果杨基因全长９１８ｂｐ，蛋白氨基酸残基数为３０５，相对分子质量３４６５５．３３，逡逑等电点ＰＩ为６．７１，呈酸性，为不稳定蛋白，疏水性蛋白。通过分析工具Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋Ｄｏｍａｉｎ逡逑Ｓｅａｒｃｈ邋Ｓｅｒｖｉｃｅ邋（ＣＤＳｅａｒｃｈ）预测毛果杨蛋白的结构域的氨基酸序列在１２－１３７位处
的重组质粒转化到农杆菌ＧＶ３１０１中，随机挑取培养基上的单克隆，进行质粒ＰＣＲ验逡逑证。ＰＣＲ结果显示，ＰＣＲ产物条带大小与目的条带大小一致，因此确定ｐＲＯＫｌＩ－逡逑重组质粒成功转化到农杆菌ＧＶ３１０１中（图３－１）。逡逑图邋３－１邋ｐＲＯＫＨ－ＰａＡ＾Ｃｉ邋菌液邋ＰＣＲ邋结果逡逑Ｍ：邋ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ５０００；邋１－８：邋ｐＲＯＫｌＩ－尸菌液邋ＰＣＲ邋产物；逡逑３．３．２毛果杨转基因烟草抗性植株的获得及鉴定逡逑３．３．２．１毛果杨转基因烟草抗性植株获得逡逑通过农杆菌介导法进行烟草的遗传转化，培养在含有４５ｍｇ／Ｌ邋Ｋａｎ的ＭＳ分化培养逡逑基中（图３－２－Ａ），获得抗性愈伤，培养一段时间后，转到含有５０ｍｇ／ＬＫａｎ的ＭＳ分化逡逑培养基中（图３－２－Ｂ），获得抗性芽，移至ＭＳ生根培养基中进行生根（图３－２－Ｃ）。逡逑图３－２毛果杨ＡｒＡ＾ＩＣ／转勵Ｎ烟草的获得逡逑Ａ：毛果杨转基因烟草抗性愈伤；Ｂ：毛果杨Ｐ／ｒＡ６４Ｃ／转基因烟草抗性芽；逡逑Ｃ：毛果杨尸／ＭＭＣ？转基因烟草抗性植株逡逑３．３．２．２毛果杨竹R嚕茫纷蜓滩菘剐灾仓甑募ㄥ义希保睿校颍睿郑剩茫蜓滩菘剐灾仓甑募ㄥ义咸崛》亲蜓滩莺退凶蜓滩菀镀埽模危粒⒆魑０澹穑遥希耍桑桑义希疲椅铮镄蛄屑恚常担校校茫壹觳猓校茫姨逑导恚常叮澹校茫页绦蚣恚常义希罚耘└司柿Ｗ魑粜远哉眨亲蚝退魑跣远哉眨校茫医峁允荆铄义希玻埃义
本文编号：2832890
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