马铃薯StCPI基因的分子克

发布时间：2020-10-11 09:10

　　 马铃薯是全球第四大重要粮食作物,其营养丰富、种植广泛,作为粮菜两用的作物深受市场欢迎。马铃薯生长发育过程中易受高盐、干旱等非生物胁迫影响,严重影响其产量与品质。因此发掘马铃薯抗逆相关基因并对其功能进行深入研究具有重要意义。半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine protease inhibitor,CPI)在植物体内分布广泛,其参与植物体对环境胁迫的应答、细胞程序化死亡(programmed cell death,PCD)、植物体新陈代谢调节等。本研究从商用四倍体栽培品种“荷兰15号”中克隆得到一个马铃薯CPI基因StCPI,对其蛋白序列进行生物信息学分析并在大肠杆菌BL21(DE3)中原核表达StCPI蛋白。在高盐和干旱胁迫下验证StCPI基因在大肠杆菌的功能后构建植物表达载体PBI121-StCPI,并用二倍体过表达马铃薯植株,探讨StCPI在抗盐和抗旱中的作用。主要研究成果如下:1.克隆了一个马铃薯基因StCPI,该基因开放阅读框(open reading frame,ORF)全长为666 bp,编码221个氨基酸。分析工具Ex PASy ProtParam tool预测其编码蛋白分子式为C_(1123)H_(1770)N_(290)O_(324)S_8、分子量24.7 KD、等电点为6.88、脂肪指数为101.26、不稳定指数为25.32、平均疏水性为0.006,推测StCPI为稳定亲水蛋白。SignalP信号肽分析其N端含有23个氨基酸的信号肽,TMHMM预测跨膜区氨基酸为9.1363个,说明StCPI不具有跨膜结构域,不是膜上的受体或者定位于膜上。2.构建了pET28-StCPI原核表达重组质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达并通过Western Blot验证。融合蛋白以包涵体形式表达,将带有组氨酸(His)标签的融合蛋白通过Ni柱亲和层析纯化,透析复性后获得StCPI能显著抑制木瓜蛋白酶活性,结果表明大肠杆菌表达的StCPI体外具有CPI活性。3.过表达StCPI基因能够提升大肠杆菌的抗盐胁迫和抗干旱胁迫能力。通过0.25M、0.5 M、0.75 M、1 M的NaCl和15%、20%、25%、30%PEG8000平板的斑点生长实验及对0.5 M NaCl胁迫下的生长曲线测定,结果表明,与转pET28空载体的大肠杆菌相比,转pET28-StCPI质粒的大肠杆菌在0.5 M的NaCl高盐胁迫和30%浓度的PEG干旱胁迫条件下能够正常生长,结果表明,转pET28-StCPI质粒的大肠杆菌能够耐受0.5M的NaCl高盐胁迫,而转空pET28载体的大肠杆菌完全不能生长,前者在高盐胁迫和干旱胁迫下生长情况显著优于后者。4.过表达StCPI基因能够提升马铃薯试管苗的抗盐胁迫和抗干旱胁迫能力。选取表达量最高的OE3二倍体StCPI过表达马铃薯苗进行NaCl和干旱胁迫实验,结果表明0.2%NaCl胁迫处理3 d后野生型植株大部分死亡,表现为植株叶片的萎缩卷曲导致植株的萎蔫;超表达StCPI株系植株均能正常存活生长,但受盐胁迫影响部分叶片顶部和边缘位置出现枯黄。连续10 d干旱胁迫后,转基因植株生长情况显著好于野生型。上述实验结果表明StCPI在二倍体马铃薯植株体内的过表达能够增强植株对高盐胁迫和干旱胁迫的抗性。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S532;Q943.2
【部分图文】：

马铃薯块茎总RNA电泳结果

StCPI基因片段扩增产物电泳结果

山东农业大学硕士学位论文以马铃薯（荷兰 15 号）块茎总 RNA 反转录获得的 cDNA 为模板，以 StCPI-F、StC引物，使用 PCR 方法扩增得到 StCPI 基因的 ORF 全长序列。电泳检测如图 2 所增得到一条 666 bp 的 DNA 条带，扩增量较大，特异性强，片段大小与预测结果一阴性对照未出现条带，说明目的基因被成功克隆出，将该基因命名为 StCPI。.3 测序结果比对将 PCR 产物纯化后回收，委托北京华大基因研究公司检测。碱基序列如图 3 所测序获得序列使用 DNAMAN 与 NCBI 上的马铃薯 CPI 基因序列（XM_0063538对，结果表明二者同源性为 100%，表明 StCPI 基因被成功克隆出。
【参考文献】

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本文编号：2836385