菘蓝IiYUCCA6基因的克隆及其功能研究

发布时间：2020-10-13 08:25

　　 菘蓝(Isatis indigotica Fort.)是十字花科(Cruciferae)菘蓝属(Isatis)两年生草本植物,其干燥的根和叶入药分别称为板蓝根和大青叶。IAA作为内源生长激素,在植物的生长发育过程中发挥重要作用,YUCCA家族基因是IAA吲哚-3-丙酮酸(IPA)合成途径中的关键限速酶基因。目前,尚无菘蓝YUCCA家族基因的研究报道。本研究基于菘蓝转录组数据信息,从10个候选内参基因中,筛选出适宜于不同研究条件的最适内参基因;并进一步运用qRT-PCR技术探究了菘蓝YUCCA基因家族成员的表达模式;最后,对IiYUCCA6基因进行克隆和生物信息学分析,并构建相应的亚细胞定位载体、原核表达载体和过表达载体,对其功能进行了初步研究。本研究所得主要实验结果如下:(1)基于geNorm和NormFinder分析结果,从10个候选基因中确定了在菘蓝不同发育阶段、不同组织部位和不同非生物胁迫条件下适用于qRT-PCR技术的最适内参基因分别为IiPP2A-4,IieIF2和IiRPL15。(2)对菘蓝 YUCCA 基因家族成员(IiYUCCA2、IiYUCCA5、IiYUCCA6 和IiYUCCA8)在不同组织部位、不同发育时期的表达情况进行了研究,结果表明:对于不同组织部位而言,IiYUCCA5基因在根中表达水平最高,而liYUCCA2、IiYUCCA6和IiYUCCA8则在老茎和老叶中的表达具有明显优势;对于不同发育时期而言,LiYUCCA6在花期的表达水平最高,IiYUCCA2、IiYUCCA5和IiYUCCA8在幼苗期的表达水平高于其他发育阶段。(3)对菘蓝 YUCCA 基因家族成员(IiYYUCCA2、IiYUCCA5、IiYUCCA6 和IiYUCCA8)在不同非生物胁迫诱导条件下的表达情况进行了研究,结果表明:干旱能够有效诱导IiYUCCA6和IiYUCCA8的高表达,并在一定程度上抑制IiYUCCA2和IiYUCCA5的表达。盐胁迫对IiYUCCA5基因的表达呈现初期抑制,后期促进的影响,而对IiYUCCA2、IiYUCCA6和IiYUCCA8则具有良好的促进作用。低温诱导IiYUCCA8基因的高表达,而对IiYUCCA2、IiYUCCA5和IiYUCCA6的表达则呈现前期抑制后期促进的影响作用。伤害处理对IiYUCCA2、IiYUCCA5、IiYUCCA6和IiYUCCA8表达的影响作用较为一致,均表现为前期抑制,后期促进。(4)对菘蓝IiTYUCCA6基因(Genbank登录号:KY318462.1)进行了克隆和生物信息学分析,结果表明:该基因的ORF区全长为1,335 bp,编码444个氨基酸;分子量为49.78 kDa,等电点为8.71,无跨膜结构域,无信号肽,属亲水性蛋白,包含FMO黄素单加氧酶的所有保守基序,可能定位于细胞质中。进一步通过多序列比对以及系统进化分析发现,IiYUCCA6基因的氨基酸序列与十字花科植物萝卜(Raphanus sativus)的亲缘关系最近。(5)构建IiYUCCA6亚细胞定位载体,运用根癌农杆菌GV3101介导的遗传转化方法浸染洋葱内表皮细胞,荧光显微镜观察结果显示,该基因表达的蛋白主要分布于细胞质中,而在细胞核中也有少量分布。(6)构建IiYUCCA6基因原核表达载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3),探究其在大肠杆菌表达系统中诱导融合蛋白表达的最优条件。结果显示:该融合蛋白表达的最佳条件为0.5 mMIPTG,37 ℃下诱导3 h,且主要以包涵体的形式进行表达。(7)构建IiYUCCA6基因过表达载体,并转化烟草,共获得10个阳性转基因株系。其中,目的基因表达量最高的两个阳性株系3和9,其表型呈现株高增加、顶端优势明显等高生长素表型,且IAA含量也有所升高,分别达到对照的1.20和1.19倍;进一步对这两个株系中生长素响应基因的表达水平进行检测,结果显示NtIAA8、NtIAA16、NtGH3.1和NtGH3.6相对于对照组表达水平均有显著性升高,分别达到对照的2.7、15.2、8.0、59.6倍和6.5、26.9、3.7、42.0倍;同时,对这两个阳性株系进行黑暗胁迫处理后发现,处理7 d后,相对于对照组,叶绿素含量下降比例显著性降低、H202含量增加值显著性减少。此外,黑暗处理7 d后,衰老相关基因NtSAG12的表达水平也显著降低。因此,IiYUC,CA6基因在烟草中异源表达,能够有效延缓植物在黑暗条件下的衰老进程,表现出一定程度的抗逆性。
【学位单位】：陕西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S567.239
【部分图文】：

Ｆｉｇ．?２－１?Ｔｈｅ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?１０?ｃａｎｄｉｄａｔｅ?ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ?ｇｅｎｅｓ??以菘蓝叶片的第一链ｃＤＮＡ为模板，分别以１０个候选内参基因的ｑＲＴ－ＰＣＲ??引物进行实时定量ＰＣＲ扩增，所得熔解曲线如图（图２－２），结果显示所有基因??的扩增曲线均呈现单峰，表明引物的特异性较好。??ｆｌＷｉ?ｔ－ｉｒ．?Ａ?６ＷＳ?ｍｃｔ－?Ａ??ｓ：?八?，：?八??，？＊１Ｃ?Ｊ?＼?／?＼??。《５?Ｊ?＼?〇？〇？???Ｊ?＼??０?９Ｃ０???０?０００?＾?—??ｍｏｃ?ｒｔａｔ?ｎＭ?ｎｏ？?？：〇？?ｍｍ?ｎｏｔ?ｍｃｏ?ｍｓｏ?ｍｍ?ｍｄｃｍｃｏ?？ｚｏｅ?＊ｓｅｅ?ｎ＜ｃ?ｓ：？ｏ?＊？ｏｅ?ｒｅｅ?？：〇？?ｍｍ?ｍｏｏ??ｉ广?八?Ａ???Ｊ?＼?，：???Ｊ?＼??■???ｅｏｏｔ?＾???ｅ？〇ｅ?Ｍｅｏ?ｔｊｏｏ?ｒｊａｃ?ｙ￥ｃｅ?ｎｏｃ?ｍｍ?？７〇？?？？？ｃ?ｓｊ？?ｕｔｔ?ｈｂｏ?ｔｊｋ?ｎａａ?ｎｓｔ－?＊ｓｗ?ｍｏｏ?ｐ．ｓｏ?ｍｃｏ?ｎｏｏ?？ｅｏｃ??Ｔｍｅｎｒｎｍ??ｔ８２ｊ?八?ｅｏｎ??

．－．，。??表２－２?１０个候选内参基因的引物扩增效率???Ｔａｂｌｅ?２－２?Ｔｈｅ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ?ｏｆ?１０?ｃａｎｄｉｄａｔｅ?ｇｅｎｅｓ?ｉｎ?Ｉｓａｔｉｓ?ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ?Ｆｏｒｔ．?Ｇｅｎｅ?ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎ??Ｅ?（％）ＩｉｅＩＦ２?０．９５８３?１．２０??ＩｉＡＣＴ７?０．９８２９?１．１５??ＨＰＰ２Ａ－４?０．９８５９?１．１２??ＩｉＡＰ－２?０．９８４９?１．３５??ＨＡＰＴ３?０．９９８３?１．０４??ＨＵＢＣ２９?０．９９９６?０．９７??ＨＲＰＬ１５?０．９９２０?１．０５??ＨＵＢＣ２２?０．９９９０?０．８９??ｌｉｍｅ１９?０．９８４５?０．９４???ＩｉＴＵＢ４?０．９７９０?＼Ａ２２．３．３?１０个候选内参基因的ｑＲＴ－ＰＣＲ及原始ｃｔ值分析??运用上述经检测扩增效率良好的引物，分别以不同的ｃＤＮＡ稀释２０倍后模板进行ｑＲＴ－ＰＣＲ实验，采用箱式图对所得原始ｃｔ值进行分析（如图２－３），果显示所得原始ｃｔ值质量较好。??

??迫条件下的最适内参基因。表２－３和图２－４均为ｇｅＮｏｒｍ软件分析结果，该结果表??明在不同发育阶段和不同组织部位，表达相对稳定的内参基因均为／／Ｐ尸２Ｈ??／ＭＣ７７和／／ｅ／Ｆ２
【参考文献】

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本文编号：2838951