恶臭假单胞菌KT2442鞭毛关键调控基因对菌株生物学特性的影响

发布时间：2020-10-13 17:05

　　 鞭毛是细菌膜外的主要运动器官,其生物合成需要多种蛋白的参与。鞭毛的缺陷可能影响菌膜形成和分泌蛋白分泌等生物过程。因此,对鞭毛合成关键基因进行敲除,研究鞭毛的缺失对菌株生物学特性的影响及相关生物过程的调控机制,对工业菌株的有目的性改造具有理论指导意义。本论文通过敲除恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)染色体上与鞭毛合成相关的基因,构建了鞭毛缺失的突变菌株,并通过表型分析和转录水平的分析探究各菌株鞭毛合成、六型分泌系统的调控机制。具体研究成果如下:(1)通过同源重组等分子生物学原理,分别敲除了恶臭假单胞菌KT2442菌株中fleQ、fliA、rpoN、bifA和hcp1等鞭毛合成相关,胞内信使c-di-GMP降解和细菌六型分泌系统基因,构建了ΔfleQ、ΔfliA、ΔrpoN、Δbif A和Δhcp1等突变株,同时构建了相应的回补菌株。(2)通过半固体平板运动性、分泌蛋白SDS-PAGE分析、透射电子显微镜和RT-qPCR实验,分别确定了fleQ、fli A和rpo N是恶臭假单胞菌中合成鞭毛所必需的基因,而bifA和hcp1的敲除对恶臭假单胞菌的鞭毛运动性无显著影响。其中rpoN基因的敲除对细菌的生长具有明显的影响,ΔrpoN的生长速率低于野生型,且稳定期能达到的OD也低于野生型。(3)转录组学分析发现对数前期ΔfleQ中,包含hcp1基因的六型分泌系统(T6SS)的相关基因都发生了显著上调。在对数中后期KT2442中,大多数T6SS相关的基因也发生了上调,但有个别基因在两种情况下受到了不同的调节。结果表明FleQ可能参与调控了部分T6SS基因,而不是所有的基因。同时,在ΔfleQ的转录组数据中,多个编码c-di-GMP合成或降解相关蛋白的基因受到了显著的调节。此外,胞外多糖中纤维素合成基因和细菌表面粘附蛋白编码基因lapA等在fleQ缺失的条件下受到调控。FleQ对纤维素的合成具有抑制作用,而对表面粘附蛋白的表达具有激活作用。(4)通过分泌蛋白SDS-PAGE和RT-qPCR实验,发现恶臭假单胞菌KT2442在对数中后期能分泌大量的六型分泌系统蛋白Hcp1,而在对数前期不显著。在ΔfleQ、ΔfliA、ΔrpoN中Hcp1的分泌在对数前期有不同程度的上调,明显高于该时期的野生型。结合RT-qPCR的分析,说明FleQ和RpoN对六型分泌系统的表达具有抑制作用。(5)通过T6SS活性缺失菌株Δhcp1的抗细菌实验,研究恶臭假单胞菌六型分泌系统的功能。发现该六型分泌系统对环境中竞争性菌株的生长具有拮抗作用。本课题中FleQ参与调控恶臭假单胞菌鞭毛合成、六型分泌系统、胞外多糖合成和表面粘附蛋白表达等多个生物过程,为研究和定向改造恶臭假单胞菌中的调控网络奠定基础。
【学位单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q78
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 细菌鞭毛的结构与功能
        1.1.1 细菌鞭毛的结构
        1.1.2 鞭毛相关基因的功能
    1.2 细菌六型分泌系统的结构与功能
        1.2.1 六型分泌系统的结构和功能
        1.2.2 六型分泌系统的调控
    1.3 恶臭假单胞菌KT2442及其应用
    1.4 转录组分析及应用
    1.5 立题背景与意义
    1.6 课题研究方案与目标
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株与质粒
        2.1.2 主要引物
        2.1.3 培养基及培养条件
        2.1.4 工具酶和试剂
        2.1.5 实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 分子DNA操作
        2.2.2 分泌蛋白的提取与鉴定
        2.2.3 恶臭假单胞菌及突变株的生理特性实验
        2.2.4 转录组分析
        2.2.5 fleQ突变株初步发酵生产PHA
第三章 实验结果与讨论
    3.1 恶臭假单胞菌鞭毛相关突变株的构建和生化表型分析
        3.1.1 ΔfleQ、ΔfliA、ΔrpoN、ΔbifA和Δhcp1敲除菌株和回补菌株的构建
        3.1.2 fleQ突变株的透射电镜分析
        3.1.3 生长曲线的比较
        3.1.4 鞭毛相关基因突变对运动性的影响
        3.1.5 鞭毛相关基因突变对外膜渗透性的影响
    3.2 转录组分析
        3.2.1 转录组分析总览
        3.2.2 差异表达基因的富集分析
        3.2.3 六型分泌系统相关基因的差异表达分析
        3.2.4 胞内信使相关基因的差异表达分析
        3.2.5 胞外多糖和表面粘附蛋白等基因的差异表达分析
        3.2.6 鞭毛、趋化性相关基因及其它显著调节基因的差异表达分析
    3.3 恶臭假单胞菌分泌蛋白分析
        3.3.1 P. putida KT2442在对数中后期时会分泌大量FliC和Hcp1蛋白
        3.3.2 FleQ、FliA、RpoN和BifA对P. putida KT2442鞭毛合成和六型分泌系统在蛋白水平上的影响
        3.3.3 FleQ、FliA、RpoN和BifA对P. putida KT2442鞭毛合成和六型分泌系统在转录水平上的影响
        3.3.4 FleQ、FliA、RpoN和BifA对P. putida KT2442鞭毛合成和六型分泌系统的调控分析
    3.4 恶臭假单胞菌六型分泌系统的功能分析
        3.4.1 Hcp1蛋白在细胞中的定位及hcp1的表达与细菌生长的关系
        3.4.2 Hcp1在KT2442和ΔfleQ中的表达强度比较
        3.4.3 六型分泌系统的抗细菌作用
    3.5 ΔfleQ突变株初步发酵生产PHA
主要结论与展望
    主要结论
    展望
致谢
参考文献
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

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本文编号：2839439