中缅边境间日疟原虫对氯喹等抗疟药的敏感性及基因多态性研究

发布时间：2020-10-14 07:45

　　 【目的】研究中缅边境间日疟原虫对氯喹等7种抗疟药物的体外敏感性及其相关基因的多态性。【方法】1.将分离自中缅边境经镜检与PCR确认的间日疟患者的血样进行短期体外培养,采用微量法检测间日疟原虫对氯喹、磷酸咯萘啶、磷酸哌喹、双氢青蒿素、奎宁、青蒿琥酯和甲氟奎的药物敏感性,以药物IC50值(nM)来表示。2.提取间日疟原虫的DNA,应用PCR技术对其分别扩增Pvmdrl,Pvcrt-o,Pvdhfr和Pvdhps四种基因。测序之后,与标准株Salvador I进行序列比对,得到其基因突变情况；应用Real-Time PCR方法对Pvmdrl基因进行拷贝数扩增,与Pvaldolese基因比较,得到其拷贝数情况。3.体外药物敏感性测定结果与基因突变结果结合分析,研究二者是否有相关性；分析Pvmdrl拷贝数是否与药物敏感性相关。【结果】1.体外药物敏感性测定结果：对58株中缅边境间日疟原虫进行体外培养,成功培养至裂殖体阶段共26株,其氯喹、青蒿琥酯、双氢青蒿素、甲氟奎、磷酸咯萘啶、磷酸哌喹、奎宁的IC50值(nM)的几何均数((Geometric mean)分别为65.52、9.65、7.42、33.15、76.73、34.13、41.57；几何均数的95%置信区间(95%CIof geo.Mean)分别为41.76～102.8、6.07～15.34、4.68～11.8、23.46～46.85、47.63～123.6、19.66～59.28、28.53～60.59;中位数(Median)分别为81.37、9.78、7.52、35.88、45.85、28.51、60.90。其中,氯喹不敏感株有3株,比例为11.54%。2.基因多态性研究结果：2.1 Pvmdrl基因：将中缅边境间日疟原虫培养与未培养虫株共166株的DNA进行扩增,得到Pvmdrl基因全序列4606bp。本研究中S513R、T529、G698S、M908L、T958M、K997R、F1076L、S1358、K1393N共9个位点均发现突变,突变率分别为11.45%、89.16%、98.8%、100%、100%、0.6%、76.51%、17.47%、19.28%,而Y976F、L1022、F1233、E1396位点均未发现突变。与氯喹敏感性相关的Y976F、F1076L位点突变率分别为0、76.51%,两个突变位点均是野生株的数目为39株(23.49%)。2.2 Pvcrt-o基因：将中缅边境间日疟原虫培养与未培养虫株共166株的DNA进行扩增,得到Pvcrt-o基因1702bp片段,本研究中所有样本均在P297位点发生了同义突变,未发现其他突变位点。2.3Pvdhps基因：将中缅边境间日疟原虫培养与未培养虫株共166株的DNA进行扩增,得到Pvdhps基因767 bp片段。本研究中S382A/C、A383G、 K512M、 A553G共4个位点均发生了突变,其中A383G、A553G位点突变较常见,突变率分别为64.45%、33.12%。常见的单倍型为SGKAV (37.35%)和SGKGV(23.49%),以及野生株SAKAV(29.52%)。四突变AGMGV、双突变SAMGV和单突变SAKGV的突变率分别为3.61%、0.60%、5.42%。2.4 Pvdhfr基因：将中缅边境间日疟原虫培养与未培养虫株共166株的DNA进行扩增,得到Pvdhfr基因632 bp片段。本研究中F57L/I、S58R、T61M、S117N/T4个位点均发生了突变,其中S58R、T61M、S117N/T位点突变最常见,突变率分别为50%、38.55%、36.75%。常见的单倍型为野生株IPFSTSI (50%)和IPLRMTI (34.94%)。双突变IPFRTT、IPFRTNI和三突变IPLRMSI的突变率分别为1.81%、9.64%、3.61%。2.5 Pvmdrl基因拷贝数：将26株体外培养成功的间日疟原虫DNA进行Pvmdrl基因拷贝数扩增,结果显示26株均为单拷贝。3.体外测定结果与分子测定结果的相关性：氯喹IC50值、氯喹敏感株与不敏感株数分别与Pvmdrl基因突变结果的相关性分析,结果显示均无相关性(P0.05)。【结论】1.中缅边境间日疟原虫存在氯喹敏感性降低的现象。2.中缅边境氯喹ICso值与Pvmdrl基因突变结果之间无相关性；氯喹敏感株与不敏感株数与Pvmdrl基因突变结果之间无相关性。3.中缅边境间日疟原虫Pvmdrl基因未出现拷贝数增加现象。4.中缅边境Pvcrt-o基因除P297位点发现同义突变以外,未发现有其他突变位点。5.中缅边境Pvdhps和Pvdhfr基因单倍型与中国中部结果比较,差异有显著性。
【学位单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：R531.3
【部分图文】：

??＿图１?２０１０年世界间日拒疾的空间分布??氯唾（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ／ＣＱ）自１９４６年Ｗ来一直被用做间日炬疾流行地区的一线??治疗药物，也用来预防间日炬疾在拒疾低风险地区的传播。然而，在炬疾流行国??家，治疗间日拒时对氯哇大规模的持续长期使用引发了氯睡抗药性的出现，导致??

■乂－－．一＇―、??Ｉ．??图２中铜边境中国柜疾感染区域??目前检测药物敏感性手段主要分为体内检测、体外检测、动物模型体内检分子标志物检测。体外药物敏感性检测技术及分子标志物检测是目前拒原虫敏性检测最常用的手段。体外药物敏感性的检测原来主要应用于恶性拒原虫，间

图３中铜边境间日炬原虫采样地??２实验仪器、试剂来源及配制??２．１主要实验仪器??
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本文编号：2840390