AtDCGS和β-Zein共表达转基因大豆材料创制及其对蛋氨酸积累的影响
发布时间：2020-10-14 07:58
大豆(Glycine max(L.)Meer.)是世界上重要的粮油兼用作物,其蛋白质含量高、成本低,是人类和家畜优质的植物蛋白质来源,具有重要的经济价值。然而,与其它来源于植物中的蛋白相似,大豆蛋白中的必需氨基酸蛋氨酸含量较低,无法满足人类和家畜的营养需求,限制了它的营养价值。因此,提高大豆蛋白中蛋氨酸的含量,对于提高大豆营养品质,改善人类膳食营养以及促进畜牧业发展具有重要的实用价值。本研究一方面利用过表达蛋氨酸合成关键酶基因AtDCGS的转基因大豆材料,与过表达富含蛋氨酸的玉米β-Zein储藏蛋白编码基因的转基因大豆材料进行杂交,将两个基因进行聚合。另一方面,构建同时携带AtDCGS和β-Zein基因的双价表达载体,进行大豆全株转化,从而获得共表达这两个外源基因的转基因大豆材料。对双价转基因大豆材料进行了除草剂抗性筛选、PCR检测、目的基因表达量检测及Southern blot检测,并在温室和田间种植进行加代和筛选。目前,通过杂交获得了10个F_3代双价转基因大豆株系,通过转化双价表达载体获得了45个T_3代双价转基因大豆株系,筛选到了CZ-6和CZ-9两个目的基因表达量高、外源基因拷贝数低且无表型异常的双价转基因株系。对部分T_2代双价转基因大豆株系和F_2代双价转基因大豆株系及其亲本的种子进行了蛋氨酸含量的检测。结果发现,与野生型相比,转AtDCGS基因的大豆籽粒中游离蛋氨酸含量最大提高到3.3倍,且种子特异型表达比组成型表达提高幅度更大。在共表达两种外源基因的转基因材料中,游离蛋氨酸含量比只转AtDCGS基因的亲本降低,同时总蛋氨酸含量比只转β-Zein基因的亲本进一步提高,推测部分降低的游离蛋氨酸用于了储藏蛋白的合成。与野生型相比,双价转基因大豆籽粒总蛋氨酸含量最大提高了22%。以上实验结果表明,通过结合蛋氨酸合成和储藏两条途径,可以进一步增加大豆籽粒内蛋氨酸的积累。检测了野生型和部分转基因大豆种子总蛋白和脂肪含量,结果发现蛋氨酸含量的提高伴随着大豆籽粒蛋白的显著增加,同时脂肪含量降低,推测游离蛋氨酸含量的不足是限制大豆蛋白积累的重要因素。因此,提高大豆籽粒内蛋氨酸含量,对于改善大豆蛋白的品质和含量都具有积极的影响。本研究通过基因工程的手段,从大豆蛋氨酸合成和储藏两方面进行调控,提高了大豆籽粒储藏蛋白中蛋氨酸的含量,改善了大豆蛋白的品质,同时也为其它作物的品质改良提供了新的思路。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S565.1
【部分图文】：
图 1.1 天冬氨酸家族氨基酸代谢调控网络（Amir et al., 2012）Figure 1.1 The metabolic networks regulating the aspartate family amino acids（Amir et al., 2012）天冬氨酸激酶（Asp kinase,AK），二氢吡啶二羧酸合酶（dihydrodipicolinate synthase, DHPS），高丝氨酸脱氢酶homoserine dehydrogenase, HSD），同型丝氨酸激酶（homoserine kinase, HK），苏氨酸激酶（Thr synthase, TS）苏氨酸脱氢酶（Thr dehydratase, TDH），胱硫醚-γ-合成酶（cystathionine γ-synthase, CGS），胱硫醚-β-裂解酶cystathionine β-lyase, CBL），蛋氨酸合成酶（Met synthase, MS），S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAM synthase, SAMS）S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine, SAM），甲基四氢叶酸（methyltetrahydrofolate, MTHF）.1.2 CGS 的表达调控CGS 被认为是蛋氨酸合成途径中的一个限速酶，它将来自天冬氨酸的碳骨架和来自半胱氨酸硫通过 γ 置换反应生成了胱硫醚，随后胱硫醚在其它酶的作用下生成了蛋氨酸，该反应遵循乒反应机制（Ravanel et al., 1998; Galili et al., 2005）。在拟南芥中，CGS 的 N 端区域具有重要的调节功能，该区域包括叶绿体转运肽序列和转录反馈调节的顺式作用元件（Hagiwara-Komoda et al., 2014）。CGS 基因的表达水平受到蛋氨酸的游产物 SAM 的负调控，这种反馈调控的靶序列位于该基因的 N 端。虽然 N 端区域对 CGS 基的表达调控具有重要作用，但是该区域缺失并不影响 CGS 的催化活性（Hacham et al., 200
图 2.1 温室 F1代杂交材料除草剂筛选(A) 喷施草甘膦和草丁膦的野生型植株，(B) 喷施草甘膦和草丁膦的杂交植株Figure 2.1 The herbicide screening of the first filial generation in green houseA) Wild-type meterials treated with glyphosate and glufosinate, (B) Crossing plant treated with glyphosate andglufosinateF2代材料种植于中国农业科学院北圃场网室中，大田种植，以野生型材料作为阴性对照施草甘膦和草丁膦除草剂。5 日后野生型材料及阴性材料叶片枯黄，阳性材料生长未见。
图 2.1 温室 F1代杂交材料除草剂筛选(A) 喷施草甘膦和草丁膦的野生型植株，(B) 喷施草甘膦和草丁膦的杂交植株Figure 2.1 The herbicide screening of the first filial generation in green house-type meterials treated with glyphosate and glufosinate, (B) Crossing plant treated with glypglufosinate料种植于中国农业科学院北圃场网室中，大田种植，以野生型材料作为阴膦和草丁膦除草剂。5 日后野生型材料及阴性材料叶片枯黄，阳性材料生
【参考文献】
本文编号：2840401
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S565.1
【部分图文】：
图 1.1 天冬氨酸家族氨基酸代谢调控网络（Amir et al., 2012）Figure 1.1 The metabolic networks regulating the aspartate family amino acids（Amir et al., 2012）天冬氨酸激酶（Asp kinase,AK），二氢吡啶二羧酸合酶（dihydrodipicolinate synthase, DHPS），高丝氨酸脱氢酶homoserine dehydrogenase, HSD），同型丝氨酸激酶（homoserine kinase, HK），苏氨酸激酶（Thr synthase, TS）苏氨酸脱氢酶（Thr dehydratase, TDH），胱硫醚-γ-合成酶（cystathionine γ-synthase, CGS），胱硫醚-β-裂解酶cystathionine β-lyase, CBL），蛋氨酸合成酶（Met synthase, MS），S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAM synthase, SAMS）S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine, SAM），甲基四氢叶酸（methyltetrahydrofolate, MTHF）.1.2 CGS 的表达调控CGS 被认为是蛋氨酸合成途径中的一个限速酶，它将来自天冬氨酸的碳骨架和来自半胱氨酸硫通过 γ 置换反应生成了胱硫醚，随后胱硫醚在其它酶的作用下生成了蛋氨酸，该反应遵循乒反应机制（Ravanel et al., 1998; Galili et al., 2005）。在拟南芥中，CGS 的 N 端区域具有重要的调节功能，该区域包括叶绿体转运肽序列和转录反馈调节的顺式作用元件（Hagiwara-Komoda et al., 2014）。CGS 基因的表达水平受到蛋氨酸的游产物 SAM 的负调控，这种反馈调控的靶序列位于该基因的 N 端。虽然 N 端区域对 CGS 基的表达调控具有重要作用，但是该区域缺失并不影响 CGS 的催化活性（Hacham et al., 200
图 2.1 温室 F1代杂交材料除草剂筛选(A) 喷施草甘膦和草丁膦的野生型植株，(B) 喷施草甘膦和草丁膦的杂交植株Figure 2.1 The herbicide screening of the first filial generation in green houseA) Wild-type meterials treated with glyphosate and glufosinate, (B) Crossing plant treated with glyphosate andglufosinateF2代材料种植于中国农业科学院北圃场网室中，大田种植，以野生型材料作为阴性对照施草甘膦和草丁膦除草剂。5 日后野生型材料及阴性材料叶片枯黄，阳性材料生长未见。
图 2.1 温室 F1代杂交材料除草剂筛选(A) 喷施草甘膦和草丁膦的野生型植株，(B) 喷施草甘膦和草丁膦的杂交植株Figure 2.1 The herbicide screening of the first filial generation in green house-type meterials treated with glyphosate and glufosinate, (B) Crossing plant treated with glypglufosinate料种植于中国农业科学院北圃场网室中，大田种植，以野生型材料作为阴膦和草丁膦除草剂。5 日后野生型材料及阴性材料叶片枯黄，阳性材料生
【参考文献】
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1 YU Yang;HOU Wen-sheng;Yael Hacham;SUN Shi;WU Cun-xiang;Ifat Matityahu;SONG Shi-kui;Rachel Amir;HAN Tian-fu;;Constitutive expression of feedback-insensitive cystathionine γ-synthase increases methionine levels in soybean leaves and seeds[J];Journal of Integrative Agriculture;2018年01期
2 韩庆梅;孙石;侯文胜;吴存祥;白肖飞;于洋;周艳峰;韩天富;;高蛋氨酸转基因大豆的鉴定和遗传稳定性分析[J];中国油料作物学报;2015年06期
本文编号：2840401
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/2840401.html
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