水稻SOMNUS同源基因在光敏色素介导的光反应中的作用初探

发布时间：2020-10-14 13:14

　　 本研究中我们利用水稻基因芯片技术,通过比较野生型水稻(Wide type,WT)和光敏色素B突变体水稻(Mutant,phyB)基因表达图谱,我们发现了一个受光敏色素B(Phytochrome,phyB)介导并被光敏色素相互作用因子OsPIL15基因调控的CCCH型中包含植物特有的TZF基序的水稻锌指蛋白基因,其在phyB中的表达水平显著高于WT,在分析该基因编码的蛋白、分析进化树及预测启动区等一系列生物信息学特征时,我们发现该水稻锌指蛋白基因与拟南芥的锌指蛋白基因SOMNUS是同源基因,将其命名为OsZFL1。为了探究OsZFL1基因在光敏色素介导的光反应中的作用,我们研究了该基因在水稻生长和发育中的作用。在本研究中,我们首先分析了该基因的生物信息学特征,其次分析了该基因的表达模式,然后构建了该基因的过表达载体和CRISPR/Cas9载体,并分别获得了该基因的过表达株系和CRISPR/Cas9株系,初步分析了OsZFL1株系的生长和发育特征。具体研究结果如下:(1)对OsZFL1基因生物信息学的基因序列、进化树、启动区预测等分析研究表明,OsZFL1基因编码的蛋白是含有TZF基序的CCCH型锌指蛋白;该基因和已报道的拟南芥SOMNUS基因是同源基因;该基因启动区内包含与光调控有关的元件Sp1,与植物激素脱落酸(ABA)反应有关的元件ABRE、motifⅡb,还有未知元件GC-motif,因此推测OsZFL1基因的表达可能受光以及植物激素ABA的调控。(2)对OsZFL1基因的表达模式研究分析表明,相对于苗期的根和叶片,OsZFL1基因在WT水稻干种子中表达量最高,当干种子吸涨后,OsZFL1的表达水平迅速下降,推测OsZFL1基因可能与种子萌发、发育有关;光周期实验显示:WT中OsZFL1基因在光期14:00时表达降低,而在暗期表达没有明显差异,说明OsZFL1基因的表达并不受光周期的影响。(3)我们构建了OsZFL1的过表达(OsZFL1-OX)载体,成功获得了OsZFL1-OX转基因株系,鉴定了OsZFL1-OX株系不同插入位点。(4)研究在OsZFL1-OX株系中ABA代谢途径关键基因的表达,RT-qPCR实验结果表明,OsZFL1基因过表达下调ABA合成代谢基因OsZEP、OsNCED1、OsNCED6基因的表达,上调ABA降解代谢基因OsABA8ox1、OsABA8ox2基因的表达,据此推测OsZFL1基因可能影响ABA的代谢途径。(5)研究在OsZFL1-OX株系中植物激素赤霉素(GA)代谢途径关键基因的表达,RT-qPCR实验结果表明,OsZFL1基因过表达上调GA3ox1、GA2ox3、GA2ox5基因的表达,据此推测OsZFL1基因可能参与水稻的GA信号途径。(6)通过分析水稻PIFs对OsZFL1表达水平的影响,我们发现在暗生长条件下,OsZFL1基因在所有OsPIL-OX转基因株系中均上调表达。而在光照条件下,除了OsPIL15株系中OsZFL1基因的表达水平较高,其它水稻PIFs过表达株系中的OsZFL1表达水平与WT差异不明显。研究结果表明,PIFs正调控OsZFL1的表达,而光信号消除了这种正调控作用,说明光敏色素互作因子OsPIL15基因可能调控OsZFL1基因的表达。(7)我们观察了光照和黑暗处理3天后OsPIL15和OsZFL1过表达种子的萌发情况,与WT相比,OsPIL15在黑暗下种子萌发不好,但OsZFL1完全没有差异,说明OsPIL15在黑暗下的萌发表型不是由于OsZFL1基因造成的。(8)我们构建了OsZFL1-CRISPR/Cas9载体,成功获得了3个靶点的OsZFL1-CRISPR/Cas9转基因株系,分析了OsZFL1-CRISPR/Cas9各单株DNA序列。(9)为了分析OsZFL1基因对光的敏感性,我们分别检测了连续红光和远红光处理后WT和OsZFL1株系的胚芽鞘伸长和第一不完全叶的受抑制情况。OsZFL1-OX株系的胚芽鞘及第一不完全叶受红光和远红光照射处理后,与WT差异不明显,但是OsZFL1-CRISPR/Cas9株系的胚芽鞘及第一不完全叶受红光和远红光处理后,相对长度较WT长,说明OsZFL1-CRISPR/Cas9株系对红光和远红光的敏感性降低。(10)分析OsZFL1-OX株系对盐胁迫和干旱胁迫的抗性,研究表明OsZFL1基因能瞬时提高水稻盐胁迫耐性。(11)通过观察幼苗期WT和OsZFL1-OX株系的株高表型,我们发现幼苗期OsZFL1-OX株系的株高始终低于WT。(12)我们统计了成熟时期生长发育的OsZFL1-CRISPR/Cas9株系的重要农艺性状数据包括株高、粒数、小花数、穗长、一级枝梗数、有效分蘖数和结实率,结果分析表明,与WT相比,OsZFL1-CRISPR/Cas9株系导致单株粒数减少,但分蘖数增多,结实率与WT相差不大。通过上述研究结果,我们初步探究了OsZFL1基因在水稻生长发育中的作用。同时结合已报道的拟南芥SOMNUS基因的功能,我们初步探究了水稻SOMNUS同源基因OsZFL1基因在光敏色素介导光反应中的作用,为进一步分析OsZFL1基因在水稻生长发育中的作用奠定了基础,为深入解析光敏色素介导的光信号传导网络提供新的信息。
【学位单位】：烟台大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S511
【文章目录】：
摘要
Abstract
中英文符号说明
第一部分 文献综述
    1 CCCH锌指蛋白
        1.1 CCCH锌指蛋白的结构特征
        1.2 CCCH锌指蛋白在植物生长中的功能
    2 光敏色素在植物生长发育中的作用
        2.1 光敏色素对幼苗去黄化的调控
        2.2 光敏色素对植物株型和育性的调控
        2.3 光敏色素对植物光周期现象的调控
        2.4 光敏色素参与调控植物对生物胁迫的抗性
        2.5 光敏色素参与调控植物对非生物胁迫的抗性及ABA代谢途径
    3 PIFs在光敏色素介导的光信号传导中的作用
    4 本论文的研究意义
    5 技术路线
第二部分 实验论文
    第一章 通过生物信息学分析OsZFL1基因和OsZFL1蛋白
        1 材料与方法
        2 结果与分析
            2.1 OsZFL1基因的开放阅读框
            2.2 OsZFL1蛋白序列的结构
            2.3 OsZFL1蛋白的系统进化树分析
            2.4 OsZFL1启动子区上游元件的预测
        3 讨论
    第二章 OsZFL1基因的表达模式分析
        1 材料与方法
            1.1 实验材料
            1.2 方法
        2 结果与分析
            2.1 OsZFL1基因在种子、叶和根的表达量分析
            2.2 光周期对OsZFL1基因表达的影响
        3 讨论
    第三章 OsZFL1在水稻生长发育中的作用
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果与分析
            2.1 OsZFL1基因的克隆
            2.2 OsZFL1转基因株系中OsZFL1基因的插入位点检测及表达水平检测
            2.3 OsZFL1基因可能影响水稻的ABA途径
            2.4 OsZFL1基因参与调控GA信号途径
            2.5 OsPIL-OX水稻中OsZFL1基因的表达水平的分析
            2.6 OsZFL1基因对OsPIL15过表达种子萌发的影响
            2.7 OsZFL1-CRISPR/Cas9植物表达载体的构建
            2.8 OsZFL1-OX株系和OsZFL1-CRISPR/Cas9株系的光敏感性分析
            2.9 OsZFL1株系对盐胁迫和干旱胁迫的抗性分析调节
            2.10 OsZFL1基因调节水稻苗期的株高
            2.11 OsZFL1基因对水稻大田农艺性状的影响
        3 讨论
    第四章 水稻光敏色素B抗体的制备及其特异性检测
第三部分 总结
论文的主要创新点
下一步的工作计划
参考文献
致谢
附录

【参考文献】

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本文编号：2840712