梨小食心虫中肠氨肽酶N3（GmolAPN3）基因的克

发布时间：2020-10-14 16:49

　　 梨小食心虫Grapholitha molesta(Busck)是一种世界性的蛀果类害虫。以幼虫蛀食多种蔷薇科果树的嫩梢和果实。过度依赖化学农药防治梨小食心虫的效果并不理想,且杀伤天敌、污染环境、导致农药残留和抗性产生。Bt杀虫蛋白(insecticidal crystal proteins,ICPs)对靶标昆虫具有高度的特异性并且对人和牲畜无害,利用Bt防治梨小食心虫具有高效、安全、无污染的特点,符合绿色无公害果品的要求,具有广阔的应用前景。Bt主要通过与昆虫中肠刷状缘膜囊泡(BBMV)上受体结合而发挥杀虫作用,许多鳞翅目昆虫中肠上的Bt受体已被发现并且深入研究,但对梨小食心虫Bt受体的研究几乎未见报道。鉴于此,本研究以对Bt毒素敏感的梨小食心虫为研究对象,采用分子生物学技术对梨小食心虫中肠Bt受体氨肽酶N3 GmolAPN3基因进行克隆和表达;通过荧光定量分析了该基因在梨小食心虫不同发育时期,幼虫不同组织中的表达量;运用生物测定方法测定Bt Cry1Ac毒素对梨小食心虫2龄幼虫的毒力,比较梨小食心虫幼虫取食不同浓度Cry1Ac毒素后GmolAPN3基因的表达量变化;利用RNAi技术对梨小食心虫中肠GmolAPN3基因进行干扰。研究结果对明确Bt作用机理、研发防治梨小食心虫高效Bt制剂和转Bt基因作物具有一定的指导价值。取得的主要研究结果如下:1.利用PCR结合RACE技术,获得了梨小食心虫GmolAPN3基因的cDNA全长序列。该基因序列全长为3 249bp,开放阅读框为3 021bp,编码1 006个氨基酸,预测蛋白质分子量和等电点分别为113.9KDa和4.72,推导的氨基酸序列具有鳞翅目昆虫氨肽酶N典型结构特征,即含有9个N-糖基化位点和7个O-糖基化位点,保守结构GAMEN,锌结合位点HEXXH(X)_(18)E,N-末端具有19个氨基酸的信号肽序列,C-末端具有17个氨基酸的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定信号肽,有GluZincin superfamily Aminopeptidase N domain和ERAP1-like C-terminal domain 2个保守结构域,具有Bt受体结构特征。系统发育树分析表明GmolAPN3与其他鳞翅目昆虫的APN3在同一分支上,同为APN家族的Class3类,与大螟、小菜蛾、棉铃虫和澳洲棉铃虫的亲缘关系较近。2.对GmolAPN3蛋白进行分段原核表达,获得了4个片段原核表达的最佳条件。3.通过Real-time PCR技术检测发现,GmolAPN3基因在梨小食心虫各个发育阶段均可以表达,幼虫期基因的表达量显著高于其他时期,尤其在2龄幼虫中的表达量最高,在卵期和蛹期的表达量最低,此外,GmolAPN3基因在梨小食心虫幼虫中肠中的表达量最高。4.用不同浓度的Bt Cry1Ac毒素蛋白饲喂梨小食心虫2龄幼虫,获得Cry1Ac毒素对梨小食心虫毒力方程:y=-1.046+1.014x,LC_(50)为10.768μg/g。5.用不同浓度Bt Cry1Ac毒素饲喂梨小食心虫2龄幼虫,检测GmolAPN3基因在不同时间段的表达量,结果表明在低浓度(1.592μg/g、3.273μg/g)Cry1Ac毒素处理下,梨小食心虫2龄幼虫GmolAPN3基因的表达量均低于对照组,且呈先降低后升高的趋势,幼虫死亡率低。而在高浓度(10.768μg/g、35.427μg/g)毒素处理下,GmolAPN3基因表达量高于对照组,呈短暂升高后降低的趋势,幼虫死亡率高。6.用不同浓度的dsAPN3饲喂梨小食心虫2龄幼虫后发现,7μg/g的dsAPN3对GmolAPN3基因的干扰效率达到了60%,用Cry1Ac毒素饲喂GmolAPN3基因被干扰后的幼虫,其死亡率显著降低,初步推断梨小食心虫GmolAPN3具有与Bt Cry1Ac毒素结合的受体功能。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S433
【部分图文】：

2.3 梨小食心虫 GmolAPN3 蛋白的分段原核表达2.3.1 梨小食心虫中肠组织的收集、RNA 的提取以及 cDNA 第一链的合成方法同 2.2.1，2.2.2，2.2.32.3.2 GmolAPN3 基因片段引物的设计根据梨小食心虫 GmolAPN3 氨基酸序列的结构特点，将 GmolAPN3 分成以下 4 个部分，其中需要去掉 N-端的信号肽序列，C-端的 GPI 锚定序列，根据氨基酸片段寻找对应的基因序列并设计分段克隆的引物。

图 3.1 梨小食心虫中肠 RNA 琼脂糖凝胶电泳Fig. 3.1 Agarose gel electrophoresis of RNA from midgut of Grapholith 提取的梨小食心虫中肠 RNA 经过 1%的琼脂糖凝胶电泳检 5S 三条带且 28S 及 18S 条带清晰（图 3.1），表明所提取的 1.9-2.0 之间，所提取 RNA 的完整性及纯度已达到反转录

图 3.4 GluZincin superfamily Aminopeptidase N domain（A）、ERAP1-like C-terminal domain（B）和 GmolAPN3（C）的三维结构Fig. 3.4 The 3D structure of GluZincin superfamily Aminopeptidase N domain(A),ERAP1-like C-terminal domain（B）and GmolAPN3（C）红色: GluZincin superfamily Aminopeptidase N domain; 蓝色: ERAP1-like C-terminal domain; 绿色:锌结合位点; 黑色: 其他部分.Red: GluZincin superfamily Aminopeptidase N domain; Blue: ERAP1-like C-terminal domain; Green:Zinc binding site; Black: Other parts.结构域分析表明，GmolAPN3 氨肽酶含有 GluZincin superfamily Aminopeptidase Ndomain（66—537 位氨基酸）和 ERAP1-like C-terminal domain（609-912 位氨基酸）2 个保守结构域（图 3.3），并且在 GluZincin superfamily Aminopeptidase N domain 的第373—396 位氨基酸处有锌指结构373HEXXH(X)18E396，是酶的活性位点。三维结构模型（图3.4）显示，在 GluZincin superfamily Aminopeptidase N domain 富含 α 螺旋和 β 折叠（图3.4: A）；如图 3.4: B 所示，ERAP1-like C-terminal domain 主要由 16 个 α 螺旋组成了 8
【参考文献】

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本文编号：2840928