拟南芥AtMYC2和AtHsf3协同调控基因AtSRG1表达的分子机制

发布时间：2020-10-14 17:02

　　 肌醇半乳糖苷酶(Galactinol synthase,GolS;EC 2.4.1.123)是棉籽低聚糖(RFOs)生物合成途径中的第一个关键酶,该基因GolS(SRG)参与了植物多种逆境胁迫诸如:热激(HS)、干旱、高盐、茉莉酸(JA)等,但是其参与多种胁迫的分子机制尚不清楚,因此,本研究以模式植物拟南芥为材料,采用qPCR方法分析了基因AtSRG1等受JA、HS、JA+HS胁迫处理的表达量,凝胶阻滞实验(EMSA)验证了 AtMYC2能够与AtSRG1基因的启动子结合,酵母双杂交筛选出了 AtMYC2与AtHsf3蛋白互作,qPCR技术分析了转录因子AtMYC2、AtHsf3调控AtSRG1靶基因的表达情况,旨在解析转录因子AtMYC2与AtHsf3协同调控AtSRG1基因表达的分子机制,为植物抗逆改良与分子育种提供理论基础与技术支持。具体结果如下:1.基因AtSRG1显著受JA、HS、JA+HS诱导表达,采用qRT-PCR技术结合GUS染色方法定性、定量分析了AtSRG1及其启动子受JA、HS、JA+HS三种胁迫处理不同时间的相对表达量,结果表明,基因AtSRG1不仅极其显著地受热激诱导表达,还显著受JA及JA+HS诱导表达。2.转录因子AtMYC2调控AtSRG1表达,采用凝胶阻抑实验(EMSA)分析了转录因子AtMYC2与基因AtSRG1启动子G-box顺式元件的结合情况,结果表明AtMYC2蛋白能够与G-box特异结合。同时,基因AtSRG1在突变体myc2/myc3/myc4中受JA处理后的表达量相对野生型拟南芥,显著下降,说明在JA处理下,AtMYC2调控了基因AtSRG1表达。3.AtMYC2与AtHsf3蛋白互作,采用酵母双杂交分析了 AtMYC2与AtHsf3的蛋白互作,将Hsf3不同片段构建至pAS2.1载体上,分别与AtMYC2-pACT载体,共转化酵母Y187,结果发现AtHsf3全长具有转录激活活性,自激活结构域在410-459之间,并且AtHsf3与AtMYC2蛋白互作,互作结构域是AtHsf3(410-459)。4.获得了四突变体myc2/3/4/hsf3纯合子,以三突变体myc2/3/4为母本,单突变体hsf3为父本,杂交、扩繁得到F2代拟南芥,经PCR检测,共获得了四突变体myc2/myc3/wyc4/hsf3纯合子15个单株,并且四突变体的表型与野生型拟南芥的表型没有显著差别,只是种荚内的种子数量显著减少。5.JA、HS及JA+HS对突变体根长的影响,分析了 JA、HS及JA+HS对WT、hsf3、myc2/myc3/myc4、myc2/myc3/myc4/hsf3根长的影响,结果表明,JA极其显著地抑制了野生型和突变体hsf3的根长,根长抑制率为85%,三突变体myc2/3/4和四突变体myc2/3/4/hsf3的根长抑制率为34%;而热激对野生型和突变体hsf3、myc2/myc3/myc4、myc2/myc3/myc4/hsf3的影响差异不显著。6.qPCR方法分析基因AtSRG1在突变体中的表达量,采用qPCR方法分析了基因AtSRG1在单突变体hsf3、三突变体myc2/3/4、四突变体myc2/3/4/hsf3中受JA、HS、JA+HS诱导表达量,结果表明,JA处理下,AtMYC2调控了基因AtSRG1表达,在HS处理下,AtHsf3等转录因子调控了基因AtSRG1表达,在JA+HS处理下,AtMYC2、AtHsf3等转录因子调控了基因AtSRG1表达。综上所述,本研究以创制的拟南芥四突变体myc2/3/4/hsf3等为材料,采用qPCR方法分析了基因AtSRG1等显著受JA、HS、JA+HS诱导表达,利用EMSA实验证实了 AtMYC2能够与AtSRG1基因的启动子结合,运用酵母双杂交方法筛选出了 AtMYC2与AtHsf3蛋白互作,qPCR方法分析了转录因子AtMYC2、AtHsf3调控AtSRG1靶基因的表达情况,解析了转录因子AtMYC2与AtHsf3协同调控AtSRG1基因表达的分子机制,为植物抗逆改良与分子育种提供理论基础与技术支持。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士后
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q943.2
【部分图文】：

为进一步分析基因启动子活性，以２周龄转基因仏ｒｏ－ＧＵＳ??拟南芥幼苗为材料，分别进行３７°Ｃ?（ＨＳ）、ＪＡ、ＨＳ＋ＪＡ处理，ＧＵＳ染色，结果??见图２，在正常条件下仅在根部表达，茎叶中没有表达；在ＪＡ处理下，??在根、垄中大量表达，在叶片中少量表达，并且随着ＪＡ处理时间的??延长，ＧＵＳ染色越深；在３７°Ｃ热激处理下，在根茎叶中大量表达，??ＧＵＳ颜色明显比受ＪＡ处理下的深；在ＪＡ＋ＨＳ处理下，也在根茎叶中??大量表达，在协同处理１２?ｈ、２４?ｈ时，ＧＵＳ颜色明显比ＪＡ和ＨＳ单独处理时深。??由此可见，基因也Ｓ７？Ｇ７启动子显著受ＪＡ、ＨＳ、ＪＡ＋ＨＳ诱导表达。??对基因也Ｓ７？Ｇ７启动子进行ＧＵＳ定性测定的同时，进行了?ＧＵＳ定量分析，??结果见图３，在ＪＡ处理下，ＧＵＳ活性从３０持续上调至１２０；在热激处理下，??ＧＵＳ活性从１００持续上调至１２０；在ＪＡ＋ＨＳ处理下

八１１＾〇２基因１－１０１７?５卩序列构建至卩￡１３（＾载体上，转化大肠杆菌８１＾１，挑取??阳性单克隆菌落进行ＩＰＴＧ诱导表达，表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析，结果见??图５，ＡｔＭＹＣ２融合蛋白分子量为４４?ｋＤａ，单克隆３－５都有目的蛋白大量表达。??采用Ｎｉ－ＮＴＡ树脂亲和层析对大量诱导表达的粗蛋白进行纯化，得到纯化蛋白，??结果见图５Ｂ，纯化后的蛋白产物在４４?ｋＤａ左右有清晰的条带。将纯化的蛋白??ＡｔＭＹＣ２进行ｗｅｓｔｅｒｎ杂交，结果见图５Ｃ，抗Ｈｉｓ标签兔单克隆抗体可以和纯化??后的ＡｔＭＹＣ２融合蛋白发生特异性结合，且与预期大小４４ｋＤａ左右相一致，说??明纯化的融合蛋白是带有Ｈｉｓ标签的目的蛋白。??４Ａ?４Ｂ?４Ｃ??Ｍ?１?２?３?４?５?Ｍ?１?２?３?４?５?，?７?８?Ｍ?１??ｓ〇ｋＤ?—?誦＿?ａ?＇?…ｎｚ?一，?＇??６０?ｋＤ?＇?，灰…?？?■?心、??——＾１?ｓ〇ｋＤ?—ｍ??■?ｎ?＊?■?—?４０?ｋＤ??３０?ｋＤ?—戀?Ｑ?３０ｋＤ?—?口?：?％（’、、??２０ｋＤ?一…署Ｓ?細一?：獅？．??图５原核表达蛋白ＡｔＭＹＣ２的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测??Ｆｉｇ．?５?Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＡｔＭＹＣ２?ｉｎ?Ｅ．?ｃｏｌｉ?ｓｔｒａｉｎ?ＢＬ２１??图５Ａ

图７基因Ａ５７？Ｇ／在突变体中的表达量??Ｆｉｇ．?７?Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｐａｔｔｅｒｎｓ?ｏｆ?ＡｔＳＲＧｌ?ｉｎ?ｍｕｔａｎｔ?ｍｙｃ２／３／４?ｗｉｔｈ?ＭｅＪＡ?ｔｒｅａｔｍＡｔＭＹＣ２与ＡｔＨｓｆ３蛋白互作??由前期实验己证明，ＡｔＭＹＣ２能够结合基因也Ｓ７？Ｇ７启动子的Ｇ－ｂｏ而调控其表达，己有文献报道热击转录因子ＡｔＨｓｆ３也能够结合基子的ＨＳＥ顺式元件从而调控其表达，那么，转录因子ＡｔＭＹＣ２蛋白互作呢？为此，采用酵母双杂交分析了?ＡｔＭＹＣ２与ＡｔＨｓｆ３的于转录因子ＡｔＨｓｆ３具有自激活活性，因此设计了不同的片段载体上，见图８Ａ，转化酵母Ｙ１８７，涂布在双缺平板上ＳＤ／－Ｌｅｕ－Ｔ单克隆３－５个，与液体ＳＤ／－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ中过夜培养，涂布在添加不同三缺平板上ＳＤ／－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ－Ｈｉｓ，由结果（图８Ｂ）看出，含有ＡｔＨｓｆ－－
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1 孙占敏;拟南芥AtMYC2和AtHsf3协同调控基因AtSRG1表达的分子机制[D];中国农业科学院;2018年

本文编号：2840939