鲤鱼转录因子Pax5基因克隆及其功能的初步研究

发布时间：2020-10-17 22:31

　　 转录因子Pax5(也称为B细胞特异激活蛋白),Pax家族成员,在B细胞发育过程中,自淋巴祖细胞阶段至成熟B细胞阶段均表达,其编码的B细胞特异激活蛋白是定位于B细胞核的反式作用元件,对B细胞的成熟分化具有重要的作用。本研究以我国常见的淡水鱼种——鲤鱼为材料,提取头肾总RNA,反转cDNA作为模板,经PCR扩增得到1263bp的Pax5 X1和1191bp的Pax5 X5两种剪切体的ORF全长,并对其进行保守结构域预测、蛋白质结构模型和功能预测和进化分析。实验构建了嗜水气单胞菌免疫刺激鲤鱼模型,通过浸泡和注射两种方式,在刺激后的不同时间点取材免疫及粘膜相关组织,通过定量PCR检测了Pax5基因的表达变化。结果表明,Pax5在头肾、脾脏、肝脏、前肠、中肠和后肠中均有表达。注射刺激中头肾表达最高,肠组织各段中前肠表达量最高。经注射免疫刺激后,在头肾和脾脏中出现显著的表达下调。浸泡刺激中头肾、脾脏表达较高,肠组织各段中后肠表达量最高。经浸泡免疫刺激后,头肾、脾脏表现出显著的表达下调。实验还检测了鲤鱼早期发育阶段自受精后第1天起至孵化第29天共9个发育时期鱼体中Pax5的表达,从定量PCR的检测结果中可以看出,在鲤鱼发育阶段,Pax5基因在受精后1-2天存在母源性表达,在孵化后降低。到孵化后14天,Pax5的表达量持续增大,至孵化后29天表达量最大。由于Pax5自淋巴祖细胞阶段一直到成熟B细胞阶段进行表达,直到浆细胞停止进行表达,因此,发育期检测结果提示,受精前期以及孵化后初期应对外界环境可能存在母源性浆细胞,孵化后期Pax5表达上调,与抗体IgM的表达模式相似,这是鲤鱼自身B细胞分化成熟的阶段,这一时期Pax5的表达上调可能参与了自身B细胞分化成熟的过程。为了进一步验证,实验利用构建的Pax5的原核表达体系,诱导表达Pax5蛋白,并制备Pax5多克隆抗体,从蛋白水平对上述不同发育时期的鲤鱼组织总蛋白中Pax5的表达进行了western-blot检测,从结果中可以看出,与mRNA水平的定量PCR检测结果较为一致,在鲤鱼早期发育阶段的个体中,至孵化后29天达到在该检测时间范围内的蛋白表达量的最大值,但是与成鱼血清中Pax5的表达量相比,仍然表达量略低。并用IgM多克隆抗体,从蛋白水平对上述不同发育时期的鲤鱼组织总蛋白中IgM的表达进行了western-blot检测,从结果中可以看出,与mRNA水平的定量PCR检测结果较为一致,在鲤鱼早期发育阶段的个体中,至孵化后29天达到在该检测时间范围内的蛋白表达量的最大值,高于成鱼血清中Pax5的表达量,提示Pax5可能在IgM抗体生成细胞的分化中发挥作用。特异性免疫最早产生于低等脊椎动物鱼类,因此,对鱼类特异性免疫相关分子及免疫细胞的研究将有助于深入的了解特异性免疫的起源和进化,而转录因子既可以作为区分不同发育阶段B淋巴细胞类群的辅助方法,同时也是认识B细胞的分化成熟机制的重要依据,正因为如此,对鲤鱼Pax5基因的克隆及其功能的初步研究对于鱼类B细胞成熟及其介导的特异性免疫机制的深入探讨具有非常重要的意义。本研究通过克隆鲤鱼Pax5基因,原核表达其蛋白并制备抗体为进一步在分子和细胞水平对Pax5的功能研究奠定了基础,同时对免疫刺激条件下及不同发育时期Pax5在组织及个体水平的表达变化及其机制的研究提供了参考和选择。
【学位单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

图 1-1 早期淋巴生成过程中谱系的基因调控（引自 Michael SchebesFig 1-1 Genetic control of lineage commitment in early lymphopoiesis(Cited from M1.3 通过 E2A 和 EBF 控制免疫球蛋白基因的重组B 淋巴细胞生成全部的不同的抗体，用于体液防御大量的抗原。全部的胞发育中分别通过对 IgH 和 IgL 基因的连续重新安排 (免疫球蛋白轻链)免疫球蛋白基因的重组取决于四个特定淋巴蛋白质的活性。V(D)J 重组RAG2 蛋白质组成，识别出重组信号序列，在信号编码边界高度特异阻断E2A 和 EBF 控制 VDJ 重排，至少通过 RAG1 和 RAG2 的部分表达调控。E2A 和 EBF 在 V(D)J 重组中更直接的作用最近在非淋巴细胞的实验中明。在人类胚胎肾脏细胞系的异位表达，E2A 或 EBF 蛋白能和 RAG1 和

山东师范大学硕士学位论文的激活，反过来又可以抑制 XBP1。然而，仅 Pax5 的丧失确实不会阻止在成熟的 Pax5 陷型 B 细胞中 XBP1 表达，表明其他转录因子在终末分化期间参与激活 XBP1。很有可是与转录因子 ATF6 结合激活 XBP1 启动子以响应内质网（ER）应激[26]。大幅增加早浆细胞中的抗体合成导致非折叠蛋白质在 ER 中的积累，因此激活非折叠蛋白质反应，增加了在 ER 中蛋白质折叠系统能力。ATF6 组成型在 ER 表达为跨膜蛋白，仅在 ER 应时才从膜上裂开再移植到细胞核后，诱导非折叠蛋白反应的转录程序，包括 XBP1 基因激活。此外，XBP1 表达也通过 ER 压力受转录后水平控制。应激激活的内切核糖核酸最近显示 IRE1 切割XBP1 mRNA 和从而从编码区域拼接小的内含子导致产生一种新型XBP1 同种型增加浆细胞转录活性[27]。

.4.3 检测60min 灭菌的枪头挑单个菌于 Ep 管中，轻轻吹打，37管底部有沉淀，吹吸混匀，取 1μl 模板做菌落 PCR。对应条带较亮的几个分别加入到含氨苄液体培养基锥保存。培养基浑浊后，取菌样测序。结果鱼 Pax5 开放阅读框扩增预实验中发现鲤鱼 Pax5 在头肾中的表达最高，故选增结果，鲤鱼 Pax5 X1 的 ORF(1263bp）和 Pax5 X5 的
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本文编号：2845392