聚酮合酶基因簇cluster 9和Aureothin生物合成基因簇中调控因子AurD的研究
发布时间：2020-10-17 15:10
聚酮化合物种类繁多,通常具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、免疫抑制等多种生物活性,因而引起人们的广泛关注。聚酮化合物的碳链骨架由聚酮合酶催化。不同类型聚酮化合物生物合成途径的揭示,将为未来发现乃至创造新型聚酮化合物的研究指明方向。本研究以两个聚酮合酶基因簇为研究对象,利用遗传学、分子生物学、生物化学的研究方法,对基因簇的功能及调控进行了探索。1链霉菌SH-62基因组中聚酮合酶基因簇cluster 9的研究来自链霉菌SH-62的聚酮合酶基因簇cluster 9属于I型PKS,与数据库中已知的天然产物合成基因簇同源性较低,可能是一个新的天然产物生物合成基因簇。包含有聚酮合酶基因簇cluster 9的BAC质粒在Streptomyces albus中异源表达产生3个疑似的代谢产物。为了检测这3个化合物与cluster 9的相关性,采用两种基因组编辑方法,包括λ-Red介导的PCR-targeting系统和CRISPR/Cas9-CodA(sm)系统,对cluster 9中的核心pks基因进行了敲除。发现核心基因的敲除没有影响3个化合物的合成,说明它们并不是cluster 9的异源表达产物。2 Aureothin生物合成基因簇中调控因子AurD的研究Aureothin是具有良好生物活性的硝基芳香类抗生素,在其生物合成基因簇中只发现了一个潜在的转录调控因子aurD。敲除aurD基因会阻断aureothin的合成过程,而aurD基因的回补实验一直无法成功。考虑到aurD基因的过量表达可能会影响细胞的生长,因此本研究采用了基因原位回补的方法,将安装有组成型强启动子PermE*的aurD基因重新插入到原基因的敲除位点,成功获得了基因回补突变菌株。回补菌株的发酵产物分析证实aurD基因的回补能够恢复aureothin的产生,并且因为组成型强启动子增强了aurD基因的表达使得aureothin产量显著提升,进一步地证实了aurD对aureothin生物合成的正调控效应。AurD具有一个OmpR类DNA结合结构域和一个细菌转录激活结构域,属于SARP家族转录调控蛋白。为了研究AurD蛋白的调控机制,分别在大肠杆菌和链霉菌中超量表达AurD蛋白,在链霉菌中,AurD蛋白的表达量很低;在大肠杆菌中,AurD蛋白主要以包涵体形式存在。未来需要在表达系统和条件上进行进一步的优化。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q78
【部分图文】：
安莎类的利福霉素；蒽环类的柔红霉素、阿霉素等，这些化合物具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、免疫抑制等多种生物活性，因而引起人们的广泛关注[19]。聚酮类化合物的生物合成与脂肪酸的生物合成类似[20]，有相似的前体（如乙酰-CoA、丙二酰-CoA）和碳链延伸机制（克莱森缩合反应）。聚酮合酶是一类包含有多个结构域的多功能酶，其中酮基合成酶（KS）、酰基转移酶（AT）和酰基载体蛋白（ACP）是聚酮链延伸的必需结构域。KS 通过硫醇酰基转移反应接收来自上游延伸的聚酮链，然后催化与ACP结合的酰基延伸单元（如丙二酰-CoA、甲基丙二酰-CoA）的脱羧反应形成一个含有碳负离子的中间体，该中间体对延伸的酰基链进行亲核攻击，形成 C-C 键，从而使链延长。AT 严格地筛选底物，并通过硫酯交换反应将酰基转移给 ACP，形成酰基-S-ACP。ACP 能够与延伸单元或聚酮中间产物通过硫酯键共价形成磷酸泛酰巯基乙胺臂，将中间产物转移到下一个模块[21, 22]。除此之外，β-酮基可能进一步被多酶复合体中的酮基还原酶（KR）、脱水酶（DH）、烯基还原酶（ER）加工处理，形成结构多样的聚酮骨架。
聚酮合酶基因簇 cluster 9 和 Aureothin 生物合成基因簇中调控因子 AurD 的研究的一个脱羧聚合过程。II 型 PKSs 是一类游离的多酶复合体，复合体中的各个结构域反式作用，且每一个蛋白都有独立的催化功能并且在聚酮化合物合成过程中可以重复使用[23]。与 I 型 PKSs 和 II 型 PKSs 相比，III 型 PKSs 结构更加简单，通常以蛋白二聚体的形式存在并且不需要 ACP 延伸肽链。它可以在一个活性位点完成一系列的脱羧聚合反应和环化反应[24, 25]。
图 1.3 I 型 PKSs（脱氧红霉内酯合成酶）生物合成机制[26]Figure 1.3 The biosynthetic mechanism of type I polyketide（deoxyerythronolide-B-synthase）[26]2.1.2 迭代的 I 型 PKSs虽然来源于细菌的 I型 PKSs 大都是非迭代的，仍有一部分源于细菌的 I 型 PKSs有别于源于真菌的迭代的 I 型 PKSs 和源于细菌的非迭代 I 型 PKSs。它们一般具有基本的模块组成，但其排布方式不同，可分为完全迭代的 PKS（s类似于真菌的迭代）和部分迭代的 PKSs（模块的迭代）[27, 28]。完全迭代的 PKSs 即是整个 PKS 复合物的重复，能够合成如芳香族化合物 avilamycin[29]、多元不饱和脂肪酸（PUFA）EPA和 DHA[30, 31]、烯二炔类化合物 C-1027[32]、PTM 类化合物 HSAF[33, 34]。部分迭代的PKSs 则是多模块组装线中一个或两个模块的重复，通常表现为 PKSs 中的模块数少于聚酮链延伸过程中的缩合反应次数，这一现象也被形象的称为 打滑[35, 36]。近些年来报道出很多部分迭代的 PKSs。
【参考文献】
本文编号：2844956
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q78
【部分图文】：
安莎类的利福霉素；蒽环类的柔红霉素、阿霉素等，这些化合物具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、免疫抑制等多种生物活性，因而引起人们的广泛关注[19]。聚酮类化合物的生物合成与脂肪酸的生物合成类似[20]，有相似的前体（如乙酰-CoA、丙二酰-CoA）和碳链延伸机制（克莱森缩合反应）。聚酮合酶是一类包含有多个结构域的多功能酶，其中酮基合成酶（KS）、酰基转移酶（AT）和酰基载体蛋白（ACP）是聚酮链延伸的必需结构域。KS 通过硫醇酰基转移反应接收来自上游延伸的聚酮链，然后催化与ACP结合的酰基延伸单元（如丙二酰-CoA、甲基丙二酰-CoA）的脱羧反应形成一个含有碳负离子的中间体，该中间体对延伸的酰基链进行亲核攻击，形成 C-C 键，从而使链延长。AT 严格地筛选底物，并通过硫酯交换反应将酰基转移给 ACP，形成酰基-S-ACP。ACP 能够与延伸单元或聚酮中间产物通过硫酯键共价形成磷酸泛酰巯基乙胺臂，将中间产物转移到下一个模块[21, 22]。除此之外，β-酮基可能进一步被多酶复合体中的酮基还原酶（KR）、脱水酶（DH）、烯基还原酶（ER）加工处理，形成结构多样的聚酮骨架。
聚酮合酶基因簇 cluster 9 和 Aureothin 生物合成基因簇中调控因子 AurD 的研究的一个脱羧聚合过程。II 型 PKSs 是一类游离的多酶复合体，复合体中的各个结构域反式作用，且每一个蛋白都有独立的催化功能并且在聚酮化合物合成过程中可以重复使用[23]。与 I 型 PKSs 和 II 型 PKSs 相比，III 型 PKSs 结构更加简单，通常以蛋白二聚体的形式存在并且不需要 ACP 延伸肽链。它可以在一个活性位点完成一系列的脱羧聚合反应和环化反应[24, 25]。
图 1.3 I 型 PKSs（脱氧红霉内酯合成酶）生物合成机制[26]Figure 1.3 The biosynthetic mechanism of type I polyketide（deoxyerythronolide-B-synthase）[26]2.1.2 迭代的 I 型 PKSs虽然来源于细菌的 I型 PKSs 大都是非迭代的，仍有一部分源于细菌的 I 型 PKSs有别于源于真菌的迭代的 I 型 PKSs 和源于细菌的非迭代 I 型 PKSs。它们一般具有基本的模块组成，但其排布方式不同，可分为完全迭代的 PKS（s类似于真菌的迭代）和部分迭代的 PKSs（模块的迭代）[27, 28]。完全迭代的 PKSs 即是整个 PKS 复合物的重复，能够合成如芳香族化合物 avilamycin[29]、多元不饱和脂肪酸（PUFA）EPA和 DHA[30, 31]、烯二炔类化合物 C-1027[32]、PTM 类化合物 HSAF[33, 34]。部分迭代的PKSs 则是多模块组装线中一个或两个模块的重复，通常表现为 PKSs 中的模块数少于聚酮链延伸过程中的缩合反应次数，这一现象也被形象的称为 打滑[35, 36]。近些年来报道出很多部分迭代的 PKSs。
【参考文献】
相关期刊论文 前4条
1 谷燕燕;耿伟涛;宋存江;;链霉菌无痕敲除方法研究进展[J];生物工程学报;2013年08期
2 陈敏捷;王广华;戴世鲲;谢练武;李翔;;链霉菌聚酮类次生代谢产物及其生物合成基因簇[J];微生物学报;2009年12期
3 杨震;;活性天然产物和结构多样性类天然产物的合成[J];化学进展;2009年01期
4 白林泉;邓子新;;微生物次级代谢产物生物合成基因簇与药物创新[J];中国抗生素杂志;2006年02期
本文编号：2844956
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/2844956.html
最近更新
教材专著
