蛹虫草菌丝亚硒酸盐吸收转运途径及相关基因探究

发布时间：2020-10-18 14:16

　　 为初步探究蛹虫草对亚硒酸盐的转运途径,确定参与亚硒酸盐转运的蛋白和调控机制,本研究分别通过以下实验,不同pH值、亚硒酸盐浓度对蛹虫草硒吸收的影响实验、蛹虫草硒吸收过程中产生的单质硒的电镜观察、蛹虫草吸收亚硒酸盐的动力学实验和比较不同抑制剂下蛹虫草对硒吸收的差异,探究不同情况下硒可能的运输途径,并通过生物信息学的的方法,从蛋白数据库中比对出可能的转运蛋白编码基因,再通过实验验证不同条件下转运蛋白相应的m RNA表达量变化,综合以上实验结果从多方面分析验证,探究出蛹虫草吸收亚硒酸盐过程中的调节机制。主要的研究结果如下:1.不同亚硒酸盐形态(pH值)和浓度对蛹虫草硒转运途径的影响。本研究通过生物量、硒吸收总量、单位质量含硒量角度,富硒效率等富硒指标,经因素分析筛选出基础、简化和稳定的富硒优化条件,培养液pH值为8,亚硒酸盐浓度为30 mg/L蛹虫草富硒条件最优,生物量平均2.067×10~3 mg/L,硒吸收总量为平均为2.715 mg,单位富硒量10.756 mg/g,此时富硒效率约90%。通过单因素和双因素实验,结果发现蛹虫草中存在对不同形态的亚硒酸盐具有特异性的转运途径,得证不同亚硒酸盐形态(SeO_3~(2-),HSeO_3~-,H_2SeO_3)对转运蛋白亲和性不同,转运蛋白对SeO_3~(2-)(pH=8)的亲和性HSeO_3~-(pH=5)的亲和性H_2SeO_3(pH=5)的亲和性。此外水溶液中亚硒酸盐的不同离子形态,其在分子质量、分子极性、所带电荷数、空间结构等方面都存在差异,在一定程度上可以被认为不同物质,实验结果中发现不同亚硒酸盐形态存在对蛹虫草转运蛋白具有激活和调控作用。2.不同亚硒酸盐形态(pH值)和浓度对蛹虫草产生单质硒的影响。蛹虫草菌丝在富硒培养的过程中,类似某些微生物会出现―红硒现象‖,会有纳米级单质硒出现,本研究利用该原理进行电镜观察。同一pH=5条件下,设置不同亚硒酸盐浓度梯度,硒浓度范围为20 mg/L～200 mg/L,实验发现单质硒主要在胞内产生,并发现蛹虫草对亚硒酸盐的吸收和同化的存在饱和现象。而在同一亚硒酸盐浓度条件(25 mg/L)不同pH值条件下(pH=3,5,8),经富硒培养的蛹虫草菌丝,不同pH值处理的菌丝单质硒颗粒数量存在显著差异,在一定程度上也说明了不同pH值条件下的不同形态的亚硒酸盐的转运效率或途径存在差异,其中pH=3时转运效率和胞内硒含量最低。3、蛹虫硒转运途径动力学特征。pH=3条件下,蛹虫草吸收亚硒酸盐在的线性方程是y=0.002917x+0.02509,决定系数R~2=0.9492;pH=5条件下,蛹虫草的亚硒酸盐吸收量-浓度拟合曲线是非线性的,Km=76.92mg L~(-1) h-1mg~(-1),Vm=0.8986决定系数R~2=0.8986。pH=8条件下的蛹虫草的线性方程是y=0.007752x+0.02506,决定系数R~2=0.8454而pH=8的米氏方程拟合,其决定系数R~2为0.8422,结果表明H_2SeO_3运输以被动运输为主,HSeO_3~-运输以主动运输为主,而SeO_3~(2-)运输则可能为主动运输和被动运输同时作用。通过亚硒酸盐动力学实验结果和电镜观察结果,确定蛹虫草存在多种对不同形态的亚硒酸盐(SeO_3~(2-),HSeO_3~-,H_2SeO_3)存在亲和性差异的转运途径。4、利用抑制剂探究蛹虫草中硒转运蛋白。利用水通道蛋白抑制剂和阴离子通道蛋白的抑制剂在不同pH条件下,对蛹虫草吸收不同形态的亚硒酸盐进行抑制,结果证明水通道蛋白是蛹虫草中参与亚硒酸盐转运的重要转运体,并发现SeO_3~(2-),HSeO_3~-主要通过体积敏感的阴离子通道进入蛹虫草菌丝。利用磷酸盐和硫酸盐在不同pH条件下,对蛹虫草吸收不同形态的亚硒酸盐进行竞争抑制实验。实验结果发现,在pH=3时,高磷和低磷条件处理,低磷处理后抑制率达到40%,高磷处理后抑制率达到51%,pH=8时,高磷处理后蛹虫草吸收亚硒酸盐的含量不存在显著性差异,低磷处理后抑制率可达14%;pH=8时低硫处理后抑制率可达到42%,高硫处理后抑制率可达19.5%。pH=5时低硫和低磷共处理后抑制率可达到27%,而单一添加磷酸盐或硫酸盐在pH=5条件下无抑制现象。结果可以确定蛹虫草吸收盐硒酸盐的转运共用磷酸盐转运途径和硫酸盐转运途径,转运效率与亚硒酸盐的形态有关。5、蛹虫草中硒转运蛋白的生物学信息和探究其调控机制。应用生物信息学方法,根据文献选用Os NIP2:1(硫酸转运子)、pho84、pho89(磷酸转运子)、SUL2(硫酸转运子)和蛹虫草蛋白质数据库进行蛋白序列比对,选出蛹虫草中的硫酸转蛋白、磷酸转运蛋白、硫酸转运蛋白,并结合作物栽培学实验结果设计实验条件,通过RT-PCR技术检测目的基因的表达量,筛选出可靠的硒转运蛋白的编码基因如下:Os NIP2:1-analogue的CCM_00972,Pho84-analogue的CCM_09308,Su L2-analogue的CCM_00881。最后再通过设计不同的培育条件对硒转运蛋白m RNA水平的调控实验,实验结果发现蛹虫草中水通道蛋白的基因受亚硒酸盐形态和浓度的调控,而磷酸盐转运蛋白基因则受pH值、亚硒酸盐形态和浓度的调控,硫酸盐转运蛋白则可能具有与酿酒酵母中SUL2相同的(硫酸盐)使用依赖失活机制。
【学位单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S567.3
【部分图文】：

H+浓度和亚硒酸盐形态以 H2SeO3为主的情况下，蛹虫草对亚硒酸盐（H2SeO3）的吸效率较低。由图 1(c)可知，培养液中亚硒酸盐浓度为 60 mg/L，不同 pH 处理的虫草菌丝体的位质量含硒量不存在显著差异（p>0.05），此时 pH 值对蛹虫草单位质量的硒含量并无响。由图 1(d)可知，培养液中亚硒酸盐浓度为 60 mg/L 条件下，pH=5 条件处理菌丝硒效率远高于 pH=3 条件处理，两者之间存在显著差异（p<0.05）；而 pH=8 条件处理pH=5 处理没有显著差异（p>0.05）。pH=3 处理的硒吸收效率较低。再次说明在溶液较高的 H+浓度和亚硒酸盐形态以 H2SeO3为主的情况下，蛹虫草对亚硒酸盐（H2SeO的吸收效率较低。

由图 2（d）可知，在富硒培养过程中，蛹虫草的富硒效率，随培养液中亚硒酸盐的浓度的增加逐渐降低。其中培养液中亚硒酸盐浓度为 15mg/L 和 30mg/L 条件下，蛹虫草富硒效率较高，两者之间不存在显著差异（p>0.05）平均约 87.279%，而与其它较高的亚硒酸盐浓度条件下的富硒率相比都存在显著差异（p<0.05）。

、亚硒酸盐浓度对蛹虫草单质硒析出的影响质硒主要在蛹虫草菌丝体的胞内出现，是由亚硒酸盐转该现象在亚硒酸盐培育富硒蛹虫草的过程中出现，是蛹到饱和后而出现的一种保护机制。
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本文编号：2846404