拟穴青蟹胺氧化酶基因的功能研究

发布时间：2020-10-18 14:27

　　 胺氧化酶(amine oxidase)主要参与生物体内胺类物质的代谢过程,对维持生物体的神经传导、新陈代谢和细胞的生长分化等具有重要的调节作用。常见的胺氧化酶有以醌为辅因子的含铜的二胺氧化酶和伯胺氧化酶,以黄素为辅因子的单胺氧化酶;多胺氧化酶有乙酰多胺氧化酶和精胺氧化酶。单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)广泛存在于生物机体各组织中,主要分布于中枢神经系统和周围神经组织的线粒体外膜及突触前膜,是一种黄素蛋白酶。基于对底物和抑制剂的选择性和敏感性的差异,MAO被分为MAO-A和MAO-B两种亚型,并由位于X染色体上的不同的基因编码。MAO-A对5-羟色胺、去甲肾上腺素和多巴胺具有高亲和力,并且可被氯吉兰特异性抑制;MAO-B对底物苯乙胺、苄胺和色胺具有较强的亲和力,并可被司来吉兰所抑制。此外,有大量研究表明,MAO与哺乳动物的攻击性行为和人类的反社会行为密切相关。精胺氧化酶(spermine oxidase,SMO)作为一种近期被发现的多胺氧化酶,能够不经过乙酰化的过程直接氧化分解精胺产生亚精胺、苯基丙醛和活性氧H_2O_2。多胺通过与细胞内的核酸物质、受体蛋白以及胞膜上的识别分子结合,对细胞的增殖、分化和凋亡起到调节的作用。近期SMO研究的热点集中在其介导的炎症反应与肿瘤之间的关系。拟穴青蟹(Scylla paramamosain)多分布于热带或亚热带的近海河口区域,是我国重要的海水养殖经济蟹类。本研究拟穴青蟹为研究对象,并成功构建了拟穴青蟹的cDNA文库,然后利用RACE技术克隆出目的基因的cDNA序列全长,进行生物信息学分析。选择单胺氧化酶典型抑制剂槲皮素处理实验蟹,利用实时定量PCR技术对拟穴青蟹胺氧化酶基因在不同浓度槲皮素抑制下的表达模式。构建拟穴青蟹pCold-Ⅰ-SpAMO重组表达质粒,使之在表达菌株大肠杆菌中高效表达,最后对得到的重组蛋白进行功能验证。现对本文主要研究结果总结如下:1.通过RACE法成功克隆得到了拟穴青蟹的胺氧化酶基因的cDNA序列全长,综合分析后命名为:SpAMO。NCBI在线比对结果显示其与其他物种的SMO基因拥有较高的相似性。SpAMO基因cDNA全长为2599 bp,它包含一个1521 bp的开放阅读框(ORF),一个26 bp的5’-末端非编码区域,一个1052 bp的3’-末端非编码区域,共编码了506个氨基酸。氨基酸序列的前26个残基为信号肽区域,在poly-A上游11bp处发现了一个多聚的腺苷酸信号(AATAAA),此为终止信号;在SpAMO基因的3’-UTR区域发现了多个与转录稳定性相关的ATTTA(G)基序。预测的蛋白分子量为56.96 kDa,理论等电点5.04。SpAMO含有一个保守的FAD结合结构域,另外三个保守区域为PLN0568、YobN和proto_IX_ox。系统进化分析揭示拟穴青蟹SpAMO与SMO聚集在一起,并与昆虫形成无脊椎动物的一支。三级结构预测结果显示SpAMO以家鼠过氧化物N(1)-乙酰基-精胺/亚精胺的三级结构为模型,相似度为28.25%;且两者的FAD结合域三级结构高度相似,均包含一个α-螺旋和两个延伸主链。2.qRT-PCR检测发现,通过体外注射槲皮素能够抑制SpAMO的转录水平。当注射剂量为5 mg/kg/d时,SpAMO的转录水平呈波动的趋势变化,在起初的24 h内两种组织中表达量均下降,随后的2 d表达量显著上升,再接下来的2 d表达量再次下降,抑制效果要强于前24 h的水平,并且槲皮素对脑组织中SpAMO的抑制作用要强于血淋巴。槲皮素易于自动氧化,抑制的可逆性和对SpAMO弱抑制作用可能是波动变化的原因。当注射剂量为50 mg/kg/d时,抑制作用更显著,血淋巴和脑组织中的SpAMO基因的表达水平下降至原始水平的10%左右,并且SpAMO的表达量稳定在一个低水平,而且血淋巴中mRNA含量降低更显著。3.通过构建拟穴青蟹pCold-Ⅰ-SpAMO重组表达载体,转化表达菌株,对获得的重组蛋白SpAMO进行鉴定、纯化、复性和功能验证。可知,SpAMO与四种底物均可以通过氧化脱氨作用生成活性氧(H_2O_2),四种底物的平均荧光值分别为18.4、12.8、1.3和1.4。可知SpAMO对5-HT和多巴胺的氧化脱氨基作用明显强于精胺和苯乙胺,即SpAMO蛋白对5-HT和多巴胺的酶活性强于精胺和苯乙胺。所以,能够推断SpAMO在拟穴青蟹体内主要起催化5-HT和多巴胺的功能。综上所述,通过对本研究克隆得到的拟穴青蟹SpAMO基因cDNA全序列进行的生物信息学分析,结果显示SpAMO具有更多的精胺氧化酶(SMO)的分子特征,但是抑制剂实验和酶活性研究表明其也具有单胺氧化酶A(MAO-A)的功能。所以,我们推测SpAMO可能是一种特殊形式的胺氧化酶,它在拟穴青蟹体内共同承担了SMO和MAO-A的生物学功能。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

图 1-1 单胺氧化酶的催化底物Fig.1-1 The substrates catalyzed by monoamine oxidase.图 1-2 MAO-A 抑制剂氯吉兰和 MAO-B 抑制剂司来吉兰Fig. 1-2 The inhibitors of clorgyline for MAO-A and selegiline for MAO-B等哺乳动物中，单胺氧化酶 A（MAO-A）和单胺氧化酶 B（M因编码，并且位于 X 染色体上，介于 Xp11.23-11.4 连锁区域化酶 A 基因和 B 基因的克隆清楚的显示两种基因在序列上的析其 mRNA 大小分别是 4.5-5.4 kb 和 2.8-3.1 kb，外显子均为的内含子-外显子结构，两者间有 70%的同源性[28]；其主要区

图 1-2 MAO-A 抑制剂氯吉兰和 MAO-B 抑制剂司来吉兰ig. 1-2 The inhibitors of clorgyline for MAO-A and selegiline for MAO哺乳动物中，单胺氧化酶 A（MAO-A）和单胺氧化酶 B（编码，并且位于 X 染色体上，介于 Xp11.23-11.4 连锁区酶 A 基因和 B 基因的克隆清楚的显示两种基因在序列上其 mRNA 大小分别是 4.5-5.4 kb 和 2.8-3.1 kb，外显子均内含子-外显子结构，两者间有 70%的同源性[28]；其主要同，单胺氧化酶 A 的核心启动子是 SP1 的结合位点，可化酶 B 为两个 SP1 位点，可通过叠加效应激活该启动子明，MAO-A 和 MAO-B 的基因有可能来源于同一个祖先[3马鱼 MAO 的研究，阐述了所有物种 MAO 均含有三个结域、底物结合结构域和膜结合结构域[31]。通过氨基酸序列 Z-MAO 与鲑鱼的 T-MAO 相似性为 84%，同人和鼠等哺 %，在人和鼠等多种哺乳类动物中 MAO-A 和 MAO-B 具

图 1-3 人类 MAO-A 完整的结构[34]Fig. 1-3 Overall structure of human MAO-A机理相关研究表明，氨基酸残基 His382 和性过程中起着非常重要的作用，A型单胺氧的 Ile199 与底物的特异性起决定作用[35]中心也存在半胱氨酸残基，猜测该残基同时酶的辅酶，黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD） 的 Cys397 以共价键结合，定点突变实验AO-B 催化相关，同样揭示了其他比较重要 和 Arg42，这些残基与 FAD 以非共价的形38]。关于单胺氧化酶的催化机制，目前已知移途径（Single electron transfer pathway, Sgen atom transfer pathway, HAT）,第三是
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本文编号：2846417