月季铁蛋白基因RhFer1参与花瓣失水胁迫耐性和衰老进程的功能分析
发布时间：2020-10-18 15:04
月季(Rosa hybrida)作为全球的切花贸易中重要的切花之一,在产地蕾期采收,经过运输到消费者手中重新瓶插开放的过程中,往往经历典型的可逆失水胁迫。然而,月季切花可逆失水胁迫耐性的调节机制仍不清楚。铁蛋白是植物中普遍存在的一类多亚基球形蛋白,可以贮存细胞中的自由Fe2+离子,广泛参与植物的生长发育过程以及生物和非生物胁迫的响应。本研究在前期月季失水cDNA文库中,筛选出了一个快速响应可逆失水胁迫的铁蛋白(Ferritin)基因JK616449,但是其功能还是不清楚的。本课题通过酵母单杂、qRT-PCR和VIGS等方法对Ferritin的基本生化特性、转录调节、生物学功能等进行了探究,结果如下:1)克隆了 JK616449基因的全长1518bp,编码区为807bp编码了一个含268个氨基酸的蛋白,具有植物铁蛋白特有的多肽延长链(EP)和保守的Fe储存和转移序列。进化树分析表明,JK616449与AtFer1同源性最高,重命名为RhFer1。ABA和失水胁迫能够诱导RhFer1的表达。2)失水胁迫能够诱导月季花瓣Fe的总浓度升高,但游离Fe2+浓度维持不变。qRT-PCR结果表明,失水胁迫能够抑制Fe运输基因的表达。在可逆失水胁迫处理的花瓣中,Fe主要定位于细胞质和维管束,而不是液泡和质外体。此外,过氧化氢的含量和活性氧清除酶的活性也没有发生明显的变化。这些结果表明,月季花瓣可逆失水胁迫过程中,Fe平衡的维持不依赖Fe运输机制。3)沉默RhFer1降低了月季花瓣的失水胁迫耐性。花瓣中沉默RhFer1后,总的Fe浓度不变,游离Fe2+的浓度增加,过氧化氢和活性氧清除酶的活性明显升高。结果表明,沉默RhFer1使花瓣遭受了严重的Fe诱导的氧化胁迫,降低了花瓣的恢复能力。4)失水胁迫过程中RhFer1转录水平的调节是依赖RhABF2的。沉默RhABF2下调RhFer1的表达。EMSA体外试验证明,RhABF2能够与含有ABRE元件的RhFer1启动子探针结合。酵母单杂和瞬时转化烟草的体内试验表明,RhABF2能够直接靶定到RhFer1启动子上的ABRE元件,并激活报告基因的表达。5)沉默RhABF2降低了花瓣的失水胁迫耐性。在失水胁迫的花瓣中,沉默RhABF2导致更高的游离Fez+浓度,打破了 Fe平衡,积累了过氧化氢,使花瓣遭受了严重的氧化胁迫,降低了花瓣失水胁迫耐性。6)在月季花瓣自然衰老的过程中,ABA逐渐积累,RhABF2、RhFer1和Fe运输相关的基因的表达上升。沉默RhABF2和RhFer1打破Fe平衡,加速了花瓣衰老。这些结果表明,在衰老过程中,RhABF2/RhFer1调节模块与Fe运输基因,协同参与了花瓣的衰老进程。总之,在可逆的失水胁迫过程中,月季花瓣主要是通过RhABF2/RhFer1调节模块而不是Fe运输基因,调节失水诱导的游离Fe2+的水平,缓解氧化胁迫提高失水胁迫耐性。而在花瓣衰老的过程中,RhABF2/RhFer1调节模块又能与Fe运输基因协同调节Fe的回收再利用,参与花瓣的衰老进程。
【学位单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S685.12
【部分图文】：
２００１）。体内平衡的信号能够负调控解毒作用信号，这是由于细胞体内平衡的重新建立减少了损??伤对解毒信号的诱导作用。细胞体内平衡的再建立和解毒信号，共同调节了植物对失水胁迫的耐??性，影响了植物的生长（图１－２）。??离子平衡是细胞体内平衡的重要组成部分，重建离子平衡能够提高植物对于胁迫的耐性。例??如当植物遭受干旱胁迫时，ＳＯＳ相关的基因能够调节细胞内Ｎａ＋的平衡，并刺激Ｃａ２＋信号途径，??调节细胞对胁迫的响应（Ｚｈｕ，２０００）。其他一些金属离子如Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｚｎ２＋等，在细胞的新陈代??谢中也起着重要的功能。当离子浓度低于正常水平时，就会打破原生质体内的平衡，阻碍正常的??新陈代谢。相反的，离子浓度过高时，又会产生毒性对细胞造成损伤，影响细胞的完整性降低植??物的胁迫耐性（Ｂｉｒｄ?ｅｋ／．，?２０１５）。因此，重建离子平衡是提高植物对胁迫的耐性的重要因素之一。??离子的再平衡也能够影响细胞的渗透平衡，进一步影响了细胞的膨压，提高植物的失水胁迫耐性。??失水胁迫还能够激活解毒系统（Ｒｅｇｕｅｒａｄ？／．
础的生化反应中。例如硫的同化、氮的固定以及ＤＮＡ的合成和修复等（Ｒａｖｅｔ?ｅｆａ／．，２００９）。由于??Ｆｅ的不稳定性，植物细胞积累Ｆｅ到过量的水平时，非必需的Ｆｅ２＋离子会通过芬顿反应催化产生??活性氧，对细胞造成损伤（图１－３，?Ｖａｌｋｏｅｆａ／．，２００５）。因此，Ｆｅ的平衡是影响植物正常生长的??重要因素之一。由于植物不能移动，所以它们高度依赖环境。植物己经进化出了精细的内在调节??机制，控制其体内的Ｆｅ平衡，保证正常的生长。植物Ｆｅ平衡的调控主要包括Ｆｅ的吸收、运输??和储存。植物经过根的作用，将Ｆｅ从土壤中吸收到根的表皮细胞中，然后经过质外体等途径运??输至各个组织和器官中。植物中Ｆｅ主要储存在质外体、细胞膜、细胞壁以及液泡中以及铁蛋白??中（Ｂｒｉａｔ?ｅｆ?ａ／．，１９９９）。??Ｆｅ３＋?＋?０２－?—？?Ｆｅ２＋?＋?０２??Ｆｅ２＋?＋?Ｈ２〇２?—?Ｆｅ３＋?＋?ＯＨ－?＋?ＯＨ??Ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ?：?Ｏｊ－?＋?Ｈ２Ｏ２?＾?〇２?＋?〇Ｈ￣?＋?ＯＨ＇??图１－３芬顿反应过程（Ｖａｌｋｏｅｆａ／．，２００５）??Ｆｉｇｕｒｅ?１－３．?Ｆｅｎｔｏｎ?ｒｅａｃｔｉｏｎ??１．３．２植物对缺Ｆｅ胁迫的调节机制??自然界中的Ｆｅ极易被氧化，并主要以不溶的氧化态存在。由于Ｆｅ的这个特性，在土壤中可??溶性的Ｆｅ的含量，往往低于植物所需要的水平。因此，植物进化出Ｆｅ吸收的机制，来维持植物??的正常的生长和发育。目前已经证明
标准开花级数２级时采收。采收后基部插入自来水中，然后转移到实验室。将月季花枝在水中进??行修剪，保留茎杆长度约３０?ｃｍ，以及２片复叶，最后将基部插入去离子水中，平衡２?ｈ后备用。??开花级数参考Ｍａ?（２００５）的分级标准，将月季的开放程度分为下面７个级数（图２－１）。??ＩＩＨＳ??图２－１月季花朵开放级数（Ｍａｒｔ?ａ／．，?２００５）??Ｆｉｇｕｒｅ?２－１?Ｒｏｓｅ?ｆｌｏｗｅｒ?ｏｐｅｎｉｎｇ?ｓｔａｇｅｓ??２．１．２试验材料的处理??２．１．２．１失水胁迫处理??２．１．２．１．１花瓣的失水胁迫处理??在体的月季花瓣：开花级数为２级的月季花材，取自昌平南口农场温室，运输至实验室后经??修剪平衡后，放置在瓶插室（温度２５°Ｃ，湿度４０％－５０％）进行失水胁迫，经过失水０、１、３、６、??１２、２４?ｈ后取下花枝上的花瓣拍照，测量鲜重并取样，样本保存于－８０°Ｃ冰箱。??离体的月季花瓣：将平衡修剪的２级花材的花瓣取下，花瓣内侧面朝上放置于瓶插室（温度??２５°Ｃ，湿度４０％－５０％）进行失水胁迫，注意不要损伤花瓣，经过失水０、１、３、６、１２、２４ｈ后??拍照，测量鲜重并取样，样本保存于－８０°Ｃ冰箱。??１４??
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本文编号：2846456
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２００１）。体内平衡的信号能够负调控解毒作用信号，这是由于细胞体内平衡的重新建立减少了损??伤对解毒信号的诱导作用。细胞体内平衡的再建立和解毒信号，共同调节了植物对失水胁迫的耐??性，影响了植物的生长（图１－２）。??离子平衡是细胞体内平衡的重要组成部分，重建离子平衡能够提高植物对于胁迫的耐性。例??如当植物遭受干旱胁迫时，ＳＯＳ相关的基因能够调节细胞内Ｎａ＋的平衡，并刺激Ｃａ２＋信号途径，??调节细胞对胁迫的响应（Ｚｈｕ，２０００）。其他一些金属离子如Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｚｎ２＋等，在细胞的新陈代??谢中也起着重要的功能。当离子浓度低于正常水平时，就会打破原生质体内的平衡，阻碍正常的??新陈代谢。相反的，离子浓度过高时，又会产生毒性对细胞造成损伤，影响细胞的完整性降低植??物的胁迫耐性（Ｂｉｒｄ?ｅｋ／．，?２０１５）。因此，重建离子平衡是提高植物对胁迫的耐性的重要因素之一。??离子的再平衡也能够影响细胞的渗透平衡，进一步影响了细胞的膨压，提高植物的失水胁迫耐性。??失水胁迫还能够激活解毒系统（Ｒｅｇｕｅｒａｄ？／．
础的生化反应中。例如硫的同化、氮的固定以及ＤＮＡ的合成和修复等（Ｒａｖｅｔ?ｅｆａ／．，２００９）。由于??Ｆｅ的不稳定性，植物细胞积累Ｆｅ到过量的水平时，非必需的Ｆｅ２＋离子会通过芬顿反应催化产生??活性氧，对细胞造成损伤（图１－３，?Ｖａｌｋｏｅｆａ／．，２００５）。因此，Ｆｅ的平衡是影响植物正常生长的??重要因素之一。由于植物不能移动，所以它们高度依赖环境。植物己经进化出了精细的内在调节??机制，控制其体内的Ｆｅ平衡，保证正常的生长。植物Ｆｅ平衡的调控主要包括Ｆｅ的吸收、运输??和储存。植物经过根的作用，将Ｆｅ从土壤中吸收到根的表皮细胞中，然后经过质外体等途径运??输至各个组织和器官中。植物中Ｆｅ主要储存在质外体、细胞膜、细胞壁以及液泡中以及铁蛋白??中（Ｂｒｉａｔ?ｅｆ?ａ／．，１９９９）。??Ｆｅ３＋?＋?０２－?—？?Ｆｅ２＋?＋?０２??Ｆｅ２＋?＋?Ｈ２〇２?—?Ｆｅ３＋?＋?ＯＨ－?＋?ＯＨ??Ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ?：?Ｏｊ－?＋?Ｈ２Ｏ２?＾?〇２?＋?〇Ｈ￣?＋?ＯＨ＇??图１－３芬顿反应过程（Ｖａｌｋｏｅｆａ／．，２００５）??Ｆｉｇｕｒｅ?１－３．?Ｆｅｎｔｏｎ?ｒｅａｃｔｉｏｎ??１．３．２植物对缺Ｆｅ胁迫的调节机制??自然界中的Ｆｅ极易被氧化，并主要以不溶的氧化态存在。由于Ｆｅ的这个特性，在土壤中可??溶性的Ｆｅ的含量，往往低于植物所需要的水平。因此，植物进化出Ｆｅ吸收的机制，来维持植物??的正常的生长和发育。目前已经证明
标准开花级数２级时采收。采收后基部插入自来水中，然后转移到实验室。将月季花枝在水中进??行修剪，保留茎杆长度约３０?ｃｍ，以及２片复叶，最后将基部插入去离子水中，平衡２?ｈ后备用。??开花级数参考Ｍａ?（２００５）的分级标准，将月季的开放程度分为下面７个级数（图２－１）。??ＩＩＨＳ??图２－１月季花朵开放级数（Ｍａｒｔ?ａ／．，?２００５）??Ｆｉｇｕｒｅ?２－１?Ｒｏｓｅ?ｆｌｏｗｅｒ?ｏｐｅｎｉｎｇ?ｓｔａｇｅｓ??２．１．２试验材料的处理??２．１．２．１失水胁迫处理??２．１．２．１．１花瓣的失水胁迫处理??在体的月季花瓣：开花级数为２级的月季花材，取自昌平南口农场温室，运输至实验室后经??修剪平衡后，放置在瓶插室（温度２５°Ｃ，湿度４０％－５０％）进行失水胁迫，经过失水０、１、３、６、??１２、２４?ｈ后取下花枝上的花瓣拍照，测量鲜重并取样，样本保存于－８０°Ｃ冰箱。??离体的月季花瓣：将平衡修剪的２级花材的花瓣取下，花瓣内侧面朝上放置于瓶插室（温度??２５°Ｃ，湿度４０％－５０％）进行失水胁迫，注意不要损伤花瓣，经过失水０、１、３、６、１２、２４ｈ后??拍照，测量鲜重并取样，样本保存于－８０°Ｃ冰箱。??１４??
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1 刘计涛;月季铁蛋白基因RhFer1参与花瓣失水胁迫耐性和衰老进程的功能分析[D];中国农业大学;2018年
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