中蜂蜂王信息素受体基因AcOr170、AcOr10的克隆与表达以及雄蜂对蜂王信息素的选择效果

发布时间：2020-10-21 06:18

　　 蜜蜂是一种真社会性昆虫,拥有一套完善、精细的语言通讯系统,是群体与个体能够正常生长、发育与繁衍的重要保证。蜂王上颚腺信息素是蜂群中一种重要信息素,具有重要生物学功能,比如具有调控工蜂行为、促进群内工蜂参加采集活动、在蜂王婚飞过程中吸引雄蜂等。本文在对中华蜜蜂蜂王上颚腺信息素受体基因AcOr170、AcOr10的克隆与表达基础上,研究了雄蜂对蜂王上颚腺信息素的选择效果。以中华蜜蜂(Apis cerana cerana)为研究对象,采用自行设计的引物对雄蜂触角中气味受体基因(Odorant receptors 170)AcOr170的cDNA序列进行了克隆和序列分析。以探寻中华蜜蜂雄蜂气味受体AcOr170基因在近缘种昆虫间的进化差异。结果表明:中华蜜蜂雄蜂气味受体基因AcOr170的cDNA序列总长度为1556 bp,编码区序列长度为1188 bp,共编码396个氨基酸,其分子量为46.272 kDa,等电点8.96,Genbank登录号:KX264359。结构域的分析结果显示,该蛋白具有7tm-6一个保守结构域。经序列比对后发现,Or170的序列在中华蜜蜂、西方蜜蜂和大蜜蜂间的亲缘性很近。以中华蜜蜂为研究对象,采集中华蜜蜂雄蜂触角,提取其总RNA,采用RT-PCR技术克隆中华蜜蜂Or10基因的序列。利用生物信息学软件分析该基因的氨基酸序列。通过荧光定量PCR技术(quantitative real-time PCR)分析其在巢门口未性成熟、巢门口性成熟、巢脾上未性成熟、巢脾上性成熟雄蜂(分别记作:Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组)触角和大脑中的相对表达量。结果表明:克隆到中华蜜蜂Or10基因(命名为AcOr10)(GenBank登录号:MF693365)cDNA序列,长度为914 bp,编码区长738bp,编码246个氨基酸,其蛋白质分子量为28.163 kD,理论等电点为5.50。系统发育树结果显示,中华蜜蜂AcOr10与西方蜜蜂(Apis mellifera)AmOr10、小蜜蜂(Apis florea)AfOr4-like基因聚成一支;雄蜂触角中AcOr10表达量的荧光定量PCR结果表明:Ⅱ组和Ⅳ组显著高于Ⅰ组和Ⅲ组(P0.05),Ⅰ组与Ⅲ组、Ⅱ组与Ⅳ组触角中AcOr10表达量差异不显著(P0.05);雄蜂大脑中AcOr10表达量的荧光定量PCR结果表明:Ⅱ组显著高于Ⅰ组、Ⅲ组和Ⅳ组(P0.05),但后三者的差异不显著(P0.05);Ⅰ组、Ⅲ组和Ⅳ组触角中AcOr10的表达量都显著高于相同生理状态下大脑中AcOr10的表达量(P0.05),但Ⅱ组触角和大脑中AcOr10的表达量差异不显著(P0.05)。以中华蜜蜂为研究对象。分别在巢门口和巢脾上抓取雄蜂,利用行为学观察方法检测三种信息素对雄蜂的吸引效果。结果表明:10μg/μL反式-9-氧代-2-癸烯酸(9-ODA)组对巢门口雄蜂的吸引力显著高于1μg/μL组和100μg/μL组(P0.05),表明过高或过低的浓度均不能有效吸引雄蜂;1μg/μL对羟基苯甲酸甲酯(HOB)组对巢门口雄蜂吸引力显著高于10μg/μL组和100μg/μL组(P0.05),表明低浓度的HOB对于巢门口雄蜂的吸引力更强;10μg/μL组和100μg/μL组的4-羟基-3-甲氧苯基乙醇(HVA)对巢门口雄蜂的吸引力均显著高于1μg/μL组(P0.05)。另外,不同浓度的蜂王上颚腺信息素对巢脾上雄蜂的吸引力差异不显著(P0.05)。
【学位单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S891
【部分图文】：

图 1 AcOr170 基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and amino acid sequence of AcOr170：横线标注部分为 7tm-6 一个高度保守结构域。Note: the part marked in lines means a highonserved structure of 7tm-6..3.2 核苷酸序列分析所得测序结果通过 BLAST 比对，找到了 2 条与 AcOr170 同源的序列，通过 Clustal 的多重序列比对，分析 AcOr170 与其它物种的同源性（图 2）。从图 2 中能发现，气味受体的 DNA 序列长度在中华蜜蜂 Or170（AcOr170）、大蜜蜂 Or22c-likeAdOr22c-like）、西方蜜蜂 Or170（AmOr170）中有一定差异，但外显子区长度是较保守的。通过序列比对分析发现：AcOr170 与 AdOr22c-like、AmOr170 一致性分别 90.57%，87.47%。

8图 2 AcOr170 核苷酸序列与其它昆虫相应序列的比对Fig.2 Nucleotide sequences alignment of AcOr170 with that of other insects：-----代表缺少的碱基。Note: -----represent the missing base.AcOr170: Apis cerana ceranaOr170JN544932）; AmOr170: Apis mellifera Or170（NM_001242993.1）; AdOr22c-like: Apis dorsatar22c-like（XM_006619001.1）..3.3 编码区氨基酸序列分析将 AcOr170 核苷酸序列通过 Bioedit 软件按照六读框翻译得出，AcOr170 外显子编码 396 个氨基酸。经 BLAST 比对，在结果中找出 4 条与其同源的膜翅目昆虫氨酸序列（图 3）。序列比对结果表明，AcOr170 与大蜜蜂 Or22c-like（AdOr22c-like）

9图 3 AcOr170 氨基酸序列与其它膜翅目昆虫相应序列比对图Fig.3 Amino acid sequences alignment of AcOr170 with that of other insects in Hymenoptera注：-----代表缺少的氨基酸。Note: -----resperant the missing amino acid. AcOr170: Apis cerana ceranaOr170（JN544932）; AdOr22c-like: Apis dorsata Or22c-like（XM_006619001.1）; AmOr170: Apismellifera Or170（NM_001242993.1）; AfOr67a-like: Apis florea Or67a-like（XP_003692912.1）;AmOr22c-like: Apis mellifera Or22c-like（XP_006564342.1）.2.3.4 聚类分析根据 AcOr170 氨基酸同源性的比对结果，采用 Mega6.0 软件中的 NJ 法构建中华蜜蜂 Or170 与其它四种蜜蜂气味受体系统进化树（图 4）。从图 4 可以看出，中华蜜蜂 Or170 与西方蜜蜂 Or170 及大蜜蜂 Or22c-like 可以聚成一支，他们的亲缘性较近；小蜜蜂 Or67a-like 与西方蜜蜂 Or22c-like 聚成一支，他们两个亲缘关系较近，而与中华蜜蜂 Or170 亲缘性较远。
【参考文献】

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本文编号：2849759