白菜类蔬菜蜡质基因和红色基因的遗传克隆与分析

发布时间：2020-10-21 06:29

　　 普通白菜(Brassica rapa L.var.communis)和红菜薹(Brassica rapa L.var.purpurea)均是十字花科芸薹属蔬菜作物。作为叶用和薹用蔬菜,其植物组织(叶片和薹茎)表皮蜡质性状是一种重要商品性状,挖掘控制蜡质的相关基因对其分子机理进行研究,具有十分重要的应用和理论价值。另外,红菜薹起源我国,含有丰富的花青素,而植物中天然的花青素具有特殊的生理功能,如抗氧化,抑制癌细胞、预防心脑血管疾病等,因此,开展红菜薹中花青素苷合成代谢相关基因的遗传、基因克隆及其分子机理的研究,显得尤为必要。综上所述,以普通白菜(青梗菜)和红菜薹为研究对象,分别针对普通白菜(青梗菜)和红菜薹的表皮蜡质性状、红菜薹的红色性状,开展3个品质性状的遗传分析、基因克隆以及分子机理研究,对于促进白菜类蔬菜的品质育种,探究组织表皮蜡质和花青素合成代谢分子机理,都有很重要的理论和应用价值。本课题主要包括三个部分,第一部分为普通白菜(青梗菜)蜡质基因的克隆和相关分析;第二部分为红菜薹蜡质基因的克隆和相关分析;第三部分为红菜薹红色性状pur07基因的克隆和相关分析。主要研究结果如下:1.蜡质缺失体的表型分析和遗传规律分析无蜡质突变体普通白菜自交不亲和系13S126和红菜薹3号均具有叶片和薹茎光亮的特点,同时叶片表面和薹茎表面的蜡质晶体缺失严重。扫描电镜(SEM)观察发现两个蜡质突变体的叶片和薹茎表面蜡质结晶显著减少。透射电镜(TEM)观察发现两个突变体的薹茎片角质层厚度明显增厚,同时自交系13S126叶片的角质层厚度也有所增厚。生理实验表明两个蜡质突变体的细胞通透性都有所增高。GC-MS测定显示自交系13S126蜡质缺失成分包括烷烃类、醇类、脂肪酸类、酮类和蜡脂,而无蜡质红菜薹3号蜡质缺失成分主要是初级醇类。以无蜡质自交系13S126和有蜡质自交系13S106为亲本构建F1代和F2代,其中F1代群体叶面均覆盖有蜡质,F2代群体中有蜡质和无蜡质植株的分离比例符合3:1,推测自交系13S126蜡质缺失性状由1对隐性基因控制。2.普通白菜中蜡质基因Br CER1的同源克隆和群体验证在同源克隆技术基础上,克隆Br CER1基因,该基因是CER1的同源基因。通过序列比对发现Brcer1基因在无蜡质自交系13S126存在39-bp的序列丢失。同时,在一个F2群体(488个单株)中,根据丢失区域开发的基因特异引物显示与无蜡质性状单株共分离。因此将Br CER1基因作为控制自交系13S106蜡质性状的候选基因。Br CER1基因的表达量在无蜡质自交系13S126下降。3.红菜薹中蜡质基因Br CER4的精细定位和克隆利用遗传方法成功将红菜薹3号无蜡质定位于1号染色体的标记M69和M87之间,两个标记之间的物理距离为272.3 kb,该定位区间内有两个与蜡质合成相关的基因,Bra011487和Bra011470。通过序列比对发现,CER4同源基因-Bra011470(Br CER4)在无蜡质红菜薹3号中存在39bp序列丢失,同时据此所开发的标记与无蜡质重组单株(34株)共分离。因此将Br CER4基因作为红菜薹中蜡质性状的候选基因。4.BrCER1基因和Br CER4基因的表达量分析和转录本分析利用半定量RT-PCR和实时荧光RT-PCR实验对Br CER1基因和Br CER4基因的表达量进行分析,Br CER1基因和Br CER4基因的表达量分别在两个突变体中下降。同时对转录本序列的分析发现,Brcer1基因在无蜡质自交系13S126中有2个转录本,存在选择性剪切;而Brcer4基因在无蜡质红菜薹3号中也存在选择性剪切,有4个转录本。因此推测Brcer1基因和Brcer4基因中分别存在的39bp序列丢失引起m RNA的选择性剪切是导致普通白菜自交系13S126和红菜薹3号的无蜡质表型原因。5.Brcer1基因和Brcer4基因在普通白菜和红菜薹种质资源中的分布在Brcer1基因和Brcer4基因中39bp序列丢失区域分别开发基因特异标记Gene-s1和Gene-s4对无蜡质普通白菜和无蜡质红菜薹种质资源的扩增表明,Brcer1基因只控制一部分普通白菜自交不亲和系的无蜡质表型,而Brcer4基因只控制本研究中收集的红菜薹自交系的无蜡质表型。6.逆境条件下Br CER1基因和Br CER4基因的表达量变化通过对有蜡质普通白菜自交不亲和系13S106和有蜡质红菜薹D×W进行干旱、冷害和盐害处理,结果表明在Br CER1基因和Br CER4基因在不同处理条件下,表达量的变化也不尽相同。在干旱处理下下,普通白菜中Br CER1基因表达量在处理后24h最高,而红菜薹中Br CER4基因的表达量最高是在处理后的48h;在冷害处理下,普通白菜中Br CER1基因在处理后6h达到最高表达量,而红菜薹中Br CER4基因的表达量最高是在处理后12h;在盐害处理条件下,普通白菜中Br CER1基因表达量最高也是在处理后的6h,而红菜薹中Br CER4基因的表达量则是在处理后24h;7.红菜薹中红色基因pur07的精细定位和相关分析在前人对红色基因pur07初定位的基础上,通过开发分子标记和候选基因分析,将存在序列差异的Bra004162作为候选基因,该基因与MYB90同源。在红色植株的启动子区域存在5,409bp的序列插入,同时在第三个外显子上存在一个碱基的替换(G替换为A)引起一个氨基酸的改变(G变为D)。依据SNP差异开发的CAPS标记pur07-1显示与绿色性状(145株)共分离。此外pur07基因的表达量在红色植株中上调。56-4分离群体(F2:3代)中表型为深红(H)的红色植株中花青素含量大小依次为:薹茎叶蕾角果;表型为浅红(M)的红色植株中花青素含量的大小依次为:茎叶。其中深红(H)的薹茎含量最高,达到8.5mg/g,含量最低的部位是浅红(M)的叶,不足1mg/g。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S634
【部分图文】：

图 1.1 表层蜡质中的主要酰基脂肪酸成分（Yeats and Rose 2013）Fig 1.1 Major acyl-lipid classes found in cuticular waxes (Yeats and Rose 2013)

图 2.1 13S106 和 13S126 的表型Fig 2.1 The phenotype of 13S106 and 13S126体表面蜡质的细胞学特征

图 2.2 a 扫描电镜： 13S126 （glossy）图片的观察倍数为 1000 倍，bars 值为 10 μm；13S1（WT）图片的观察倍数为 1500 倍，bars 值为 10 μm；b 透射电镜：所有图片 bars 值均为 nm
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本文编号：2849771