多疣壁虎Dmrt1基因的克隆与表达分析及其在TSD中的作用

发布时间：2020-10-21 11:19

　　多疣壁虎(Gekko japonicus)是一种小型夜行性爬行动物,属于爬行纲(Reptilia),有鳞目(Squamata),壁虎科(Gekkonidae),壁虎属(Gekko),为温度依赖型性别决定(TSD)物种。本文野外采集多疣壁虎怀卵母体,进行卵孵化实验和外源激素操纵实验,检测多疣壁虎在不同孵化温度下后代性比,验证其温度依赖型性别决定模式;通过基因克隆技术获得多疣壁虎Dmrt1基因序列;通过qPCR技术检测Dmrt1基因不同组织表达以及在多疣壁虎性别决定中的表达模式,探讨了Dmrt 基因在多疣壁虎性别决定中可能发挥的作用,为进一步探究Dmrt1基因在温度依赖型性别决定的机制研究提供基础信息。1.激素操纵对多疣壁虎性别的影响孵化温度显著影响多疣壁虎后代性比,多疣壁虎属于TSD物种。但是温度并不能完全决定后代性别,通过芳香化酶抑制剂,消除温度对后代性别的影响,结果显示,芳香化酶作用后,在三个孵化温度下,雌性性别显著下降,但也没能完全逆转后代性别。本文研究进一步证明多疣壁虎属于TSD物种,同时实验结果支持多疣壁虎可能存在GSD性别决定模式,这一结果支持TSD-GSD很可能存在过渡的连续谱假说。2.Dmrt1基因克隆、序列分析本实验利用3'和5'RACE技术从多疣壁虎精巢中克隆出Dmrt1基因序列,Dmrt1长1884 bp,包括3'/5'非编码区和ORF开放阅读框。ORF编码285个氨基酸,蛋白质分子量为30.94 kDa,等电点为4.95。开放阅读框ORF从第85位核苷酸至第939位核苷酸。并对Dmrt1蛋白序列进行预测。利用Dmrt1蛋白预测序列进行多重比较分析,发现Dmrt1 基因的三段保守区段(DM binding domain, a P/S-rich region和male-specific motif)在脊椎动物中高度保守。系统树分析也表明多疣壁虎Dmrt1氨基酸序列在脊椎动物中同样高度保守。3.多疣壁虎Dmrt1基因不同组织表达及性别决定中的表达模式结果表明Dmrt1基因在多疣壁虎精巢中的表达量显著高于卵巢。同时我们还检测了其它雄性性别相关基因,Sox9、Sf1、AMH、Lhx9和WT1基因,结果精巢中的表达量同样显著高于卵巢。我们在多疣壁虎出蛰至繁殖期间检测其精巢中Dmrt1基因的表达量,结果显示Dmrt1基因在四月份精巢复苏阶段表达量达到显著水平,说明Dmrt1基因可能参与多疣壁虎精子发生;在产雄性后代较多的28℃和产雌性后代较多的32℃孵化温度下孵化多疣壁虎卵,在TSP时期检测不同发育时期Dmrt1基因的表达量,结果显示28℃孵化温度下,第35期时Dmrt1基因的表达量显著高于32℃,我们推测Dmrt1基因可能参与多疣壁虎雄性性别决定过程。
【学位单位】：温州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：Q78
【部分图文】：

模式图,爬行动物,孵化温度,模式

代；比如喙头目）、ＦＭ模式（较低孵化温度产生雌性后代，较高孵化温度产生雄??性后代；比如龟鳖目）和ＦＭＦ模式（较高和较低孵化温度均产生雌性后代，中??间孵化温度产生雄性后代；比如鳄目和蜥蜴亚目）１５Ｊ５］（图１－１）。Ｉｎａｍｄａｒ等［叫在??２０１２年的研宄发现，变色树蜥（Ｑｊ／ｏｒｅｓｖｅｒ＾ｃｏ／ｏｒ）存在着一种新的性别决定模??１??

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１实验动物??我们于２０１４年５月中旬在浙江温州（２７°８＇?Ｎ，１２０°６２ｒ?Ｅ）采集多疣壁虎怀卵??母体（图２－１）。带回温州大学实验室室温饲养，词养笼放置于不受千扰，通风、??具自然采光、阳光能自然照射的防雨环境中。内放隐蔽物，如鸡蛋托、瓦片等。??每隔２ｄ投喂１次，主要饵料为面包虫、蟋蟀、果蝇等，在食物和曝晒过的自来??水中添加钙和维生素，及时清除掉粪便及死亡的剩余食物。怀卵母体在捕获后的??３－８天后产卵。?????图２－１多疣壁虎在中国大陆的分布情况；图中黑点表示多疣壁虎的采集点。??Ｆｉｇ．?２－１?Ｔｈｅ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｇｅｋｋｏ?ｊａｐｏｎｉｃｕｓ?ｉｎ?Ｃｈｉｎａ?Ｍａｉｎｌａｎｄ；?Ｓｏｌｉｄ?ｄｏｔｓ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ?ｔｈｅ??ｓａｍｐｌｉｎｇ?ｓｉｔｅｓ?ｏｆ?Ｇｅｋｋｏ?ｊａｐｏｎｉｃｕｓ．??１０??

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