西瓜果肉硬度和酸味性状的转录组分析及主效基因的精细定位

发布时间：2020-10-21 17:10

　　 果肉硬度和果实有机酸含量是决定西瓜果肉质地和果实风味等感官品质的重要因素,是由多基因控制的复杂数量性状。传统的生理与遗传学研究方法对复杂性状的遗传本质和分子调控机制研究存在一定的局限性,进一步明确西瓜果肉硬度和果实有机酸积累的关键调控因子,可以为西瓜品质育种提供理论与技术支持。本文以野生西瓜PI271769为供体亲本,栽培种西瓜203Z为轮回亲本,分子标记结合成熟果实的表型鉴定,通过连续回交和自交创制了果肉硬度和果实酸味的近等基因系材料。通过对西瓜果实发育期的RNA样品进行比较转录组分析,BSA-Seq结合构建的分离群体对西瓜果肉硬度和酸味性状的主效基因进行精细定位研究,获得的主要结果如下:1.创制西瓜果肉硬度和酸味性状的近等基因系。通过连续7代回交和4代自交,创制了有关西瓜果肉硬度的近等基因系HWF和果实酸味的近等基因系SW。与轮回亲本203Z相比,HWF果实有较高的果肉硬度,SW果实有较高的有机酸含量,除目标性状有明显差异外,其它生物学性状基本一致。2.西瓜果肉不同发育时期细胞壁物质成分含量的测定与比较转录组分析。测定软果肉的203Z和硬果肉的HWF果实发育4个关键时期的果实中的细胞壁物质成分含量,发现原果胶、纤维素、半纤维素和共价结合果胶的含量变化与果肉硬度变化趋势一致,随着果肉硬度的增大而增加,而水溶性果胶和离子型果胶的含量伴随着果肉硬度下降而持续增加。比较转录组分析发现果胶酯酶、糖基转移酶、纤维素合成酶、多聚半乳糖醛酸酶和木葡聚糖内糖基转移酶基因在不同果肉硬度的材料中差异表达,可能通过对果肉细胞壁物质成分含量的影响来调节西瓜果肉硬度大小的变化。3.西瓜果肉硬度主效基因的精细定位。在全基因组水平上筛选与西瓜果肉硬度紧密连锁的分子标记,结合BSA-Seq对西瓜果肉硬度的主效基因进行初步定位,在此基础上,通过构建BC_7F_3分离群体和衍生的F_2次级分离群体,将该基因定位在西瓜6号染色体12780793-17658672的物理区间内,包含166个候选基因,其中木葡聚糖内糖基转移酶基因Cla004119和乙烯响应元件Cla004120在不同果肉硬度的材料中基因表达量差异显著,可能是控制西瓜果肉硬度的关键基因。4.西瓜果实不同发育期可溶性糖和有机酸含量的测定及比较转录组分析。测定203Z和SW果实发育过程中可溶性糖和有机酸的含量,发现果实中可溶性糖的含量前者稍高于后者,差异不明显;而有机酸的含量前者低于后者,差异显著。比较转录组分析发现蔗糖合成酶、蔗糖磷酸化酶及不溶性酸转化酶基因对西瓜果实中可溶性糖的积累与代谢具有重要作用,NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)依赖的苹果酸脱氢酶和铝诱导的苹果酸转运酶基因调控果实中苹果酸的积累,而柠檬酸合成酶基因决定了果实中柠檬酸的含量。5.西瓜果实酸味性状主效基因的精细定位。在BSA-Seq对西瓜果实酸味初步定位的基础上,通过构建BC_7F_2分离群体和衍生的F_2次级分离群体,最终将该基因定位在西瓜6号染色体318 Kb(4529126-4855093)的物理区间内,含有28个候选基因,结合转录组数据分析,发现仅有Cla009218和Cla009226两个基因在不同果实酸味的材料中差异表达,可能对西瓜果实中有机酸的积累起决定作用。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S651
【部分图文】：

因此近等基因系是在基因水平上开展遗传研究的理想材料。目前对西瓜果实酸味性状定位方面的研究还未见报道，并且在对西瓜果肉硬度的研究中找到的 QTL 位点与连锁的分子标记遗传距离较远，对实际育种工作意义不大。究其原因主要是西瓜果肉硬度和酸味作为复杂的数量性状遗传，缺乏理想的实验材料，成为限制分子机制研究的主要瓶颈。因此构建西瓜果肉硬度和酸味性状的近等基因系材料就显得尤为重要，将为其分子机制的研究奠定重要基础。本研究通过连续高代回交再自交的方法获得了与轮回亲本只在目标性状上有差异的近等基因系试验材料。2.1 材料和方法2.1.1 试验材料亲本试验材料 203Z 为中国农业科学院郑州果树研究所多倍体西瓜课题组经过多代自交的西瓜栽培品系（C. lanatus subsp. vulgaris）（图 2.1A），果皮浅绿色，有条纹，果肉红色，质地疏松，硬度大小平均值为1.0 kg/cm2，果实中心可溶性固形物含量平均值11.5%，pH平均值5.76；PI271769为由美国引进的非洲野生西瓜（C. lanatus subsp. lanatus）（图 2.1B），果皮和果肉均未白色，果肉坚硬，硬度平均值为 6.3 kg/cm2，果实中心可溶性固形物含量平均值 4.0%，pH 平均值 4.52。

35 个循环；最后 72℃延伸 8 min，4℃冰箱保存。扩染后拍照进行带型统计，与轮回亲本 203Z 一致的带型记为 A，两亲本均有的带型记为 H。 次的平均值，采用 SPSS 16.0 数据分析软件进行统计分行世代基因型分析。物的筛选色体上均匀分布的 185 对 SSR 引物（Guo et al., 2013PI271769 及 F1代进行多态性筛选（图 2.2），结果发现性差异，多态率为 52.4%，且多为共显性标记，说明两

图 2.5 BC7F1世代单株 1-6（硬果肉）基因型分析Fig. 2.5 Genotype analysis of 1-6 line（hard flesh）in BC7F1generation注： ：203Z 基因组， ：含有供体亲本片段的杂合基因组Note: : 203Z genome, : The hybrid genome containing donor parental fragments2.2.5 BC7F1酸果肉西瓜单株 3-10 基因型分析选择BC7F1世代西瓜果实酸味株系中的其中一个酸果肉的单株3-10进行基因型分析（图2.6），可以发现：在西瓜的第 6 染色体上存在 2 条不同长度的来源于供体亲本 PI271769 的外源片段，长度分别为 3.65 cM 和 5.05 cM,且为杂合片段，外源片段总长度为 8.7 cM,背景恢复率为 98.9%，而理论上 BC7世代背景恢复率为 99.2%。
【参考文献】

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本文编号：2850386