芜菁花青素合成光不敏感型突变体鉴定及候选基因定位分析

发布时间：2020-10-22 15:18

　　 紫外光诱导花青素合成是植物光形态建成的一种响应,是由光受体及其信号分子共同协调调节。本实验室前期研究显示:津田芜菁'Tsuda'的膨大肉质根表皮花青素合成受UV-A单色光及蓝光+UV-B复合光的诱导,有哪些光受体和信号转导因子参与该过程尚不清楚。为研究非模式植物津田芜菁对UV-A和蓝光+UV-B的反应及相关信号调控,解析芜菁中紫外光信号转导调控途径,本研究对实验室前期所获得的系列光不敏感型花青素合成突变体进行了初步鉴定包括突变表型稳定遗传突变体的F2群体构建及遗传分析、花青素合成相关基因表达初步分析,高通量测序结合MutMap分析对三个目标突变体g56w、g97w和g142w进行候选基因初步定位,获得以下结果:1.光不敏感型花青素合成突变体的遗传及下游基因表达分析野生型与花青素合成相关突变体膨大肉质根表皮见光及未见光部分的花青素含量测定揭示野生型津田芜菁花青素合成属光敏感型花青素合成模式,而突变体花青素合成模式则为光不敏感型花青素合成模式。突变体g56w、g83w、g97w、g140w、g141w、g142w和g143w在光照条件下无花青素合成,属于花青素缺失突变体表型,且经多代自交后其突变性状稳定遗传。不同突变体系之间测交分析显示,突变体之间杂交的F1代表型和野生型表型一致,推测本研究中获得的7个花青素缺失突变体的表型为不同位点突变导致。突变体g56w、g83w、g97w、g140w、g141w、g142w、g143w和g19r与野生型芜菁分别构建F2群体,表型调查及F2群体中单株个体花青素含量测定分析显示:g56w、g83w、g97w、g142w和g143w后代F2群体中,野生型表型个体与突变体表型个体分离比符合3:1,推测g56w、g83w、g97w、g142w和g143w的花青素缺失表型性状受隐性单基因控制,花青素组成型合成突变体g19r的突变表型为单基因显性遗传,g140w和g141w不符合孟德尔遗传。突变体及野生型花青素合成相关基因定量PCR分析结果显示:与野生型相比,花青素合成缺失突变体g56w、g83w、g97w、g142w和g143w中花青素合成途径的多数结构基因及转录因子的表达显著下调,如BrCHS、BrCHI、BrANS、BrDFR和BrTT8、BrPAP1等。而花青素组成型合成突变体g19r的花青素合成相关结构基因及转录因子则为显著上调表达,因此我们推测:控制突变体性状的突变基因是非结构基因突变导致的突变表型,该突变基因可能位于花青素合成途径的上游光信号网络通路中,从而能够抑制光诱导花青素的合成或调控花青素组成型的合成。2.花青素缺失突变体g56w和g97w的突变基因初步定位利用重测序结合MutMap方法进行突变体目标性状候选基因的初步定位,采用HRM技术进行后续的候选SNP位点的F2群体表型连锁分析,进一步将g56w突变位点定位在A07染色体的16,825,203到17,401,586之间的区域,间距576kb。g97w突变位点初步定位在17,221,786到17,341,239之间区域,间距119kb,主要包括具备甲基转移酶、跨膜受体蛋白、核苷酸结合蛋白、锌指蛋白、蛋白激酶、蛋白质氨基磷酸化、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶功能与活性的侯选基因。3.花青素缺失突变体g142w的突变基因定位以不同短波长光质(UV-A、蓝光和蓝光+UV-B)处理野生型芜菁和突变体g142w幼苗,结果表明野生型和g142w下胚轴花青素积累模式不同,推测突变体g142w可能是我们的目标突变体。利用HPLC比较野生型与突变体g142w中花青素类化合物的组成成分,结果显示:突变体花青素积累量发生改变,而合成代谢途径尚未发现变化。利用重测序结合MutMap方法进行突变基因定位,候选基因定位在A07号染色体的16.0Mb-18.0Mb区域内,同时利用HRM技术进行候选SNP的F2群体表型连锁分析,进一步将突变位点定位在A07染色体的16,902,778到17,061,871区域,间距159kb,结合SNP index0.8进行候选基因筛选后,该区间内包括聚半乳糖醛酸酶、酰基载体蛋白、钙调蛋白结合蛋白、受体激酶、生长素响应因子等8个功能基因。利用RNA-seq结合定量PCR数据分析推测Bra004121、Br029和Bra004136基因可能为候选基因。以上结果表明我们所获得的突变体g56w、g97w和g142w均具有花青素合成非敏感型的特性,因此,控制这一突变性状的候选基因可能参与依光型花青素合成的生物过程,这为深入分析UV-A和蓝光+UV-B诱导的植物花青素合成途径奠定了基础。
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S631.3
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
    1.1 引言
    1.2 植物中花青素合成及调控研究
        1.2.1 花青素的结构及种类
        1.2.2 参与花青素合成的结构基因
        1.2.3 花青素合成途径相关调节基因
        1.2.4 花青素合成影响因素研究进展
    1.3 光信号转导影响植物发育进程的研究进展
        1.3.1 光敏色素受体及其介导的红光、远红光信号转导
        1.3.2 隐花色素受体及其介导的蓝光信号转导
        1.3.3 趋光素受体及其介导的蓝光信号转导
        1.3.4 Zeitlupe类受体及其介导的蓝光信号转导
        1.3.5 UV-B受体及其介导的光信号转导
        1.3.6 植物光受体介导的花青素合成的研究进展
    1.4 MBS （mapping-by-sequencing）研究进展
    1.5 HRM技术及其应用
        1.5.1 HRM技术的原理
        1.5.2 HRM技术的特点
        1.5.3 HRM技术在目标基因定位中的应用
    1.6 转录组测序技术的应用
    1.7 本研究的目的及意义
2 光不敏感型花青素合成突变体的遗传及下游基因表达分析
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 实验材料
        2.2.2 实验条件
        2.2.3 实验试剂与仪器
        2.2.4 实验方法
    2.3 结果与分析
        2.3.1 野生型津田芜菁生育动态调查
        2.3.2 花青素合成相关突变体表型分析
        2.3.3 野生型和突变体花青素含量测定分析
        2.3.4 突变体之间的杂交后代表型调查
2的构建及遗传分析'>        2.3.5 突变体与野生型津田芜菁群体F₂的构建及遗传分析
        2.3.6 花青素合成途径基因表达分析
    2.4 讨论
    2.5 本章小结
3 花青素缺失突变体g56w和g97w候选突变基因初步定位
    3.1 引言
    3.2 材料方法
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 实验试剂与仪器
        3.2.3 实验方法
    3.3 结果分析
2群体中突变型后代池和野生型亲本的DNA提取及高通量测序'>        3.3.1 突变体的F₂群体中突变型后代池和野生型亲本的DNA提取及高通量测序
        3.3.2 高通量测序数据质量控制及数据分析
        3.3.3 MutMap分析
        3.3.4 花青素缺失突变体g56w基因定位
        3.3.5 花青素缺失突变体g97w基因定位
    3.4 讨论
    3.5 本章小结
4 花青素缺失突变体g142w的突变基因定位
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 实验材料
        4.2.2 实验光源
        4.2.3 实验试剂与仪器
        4.2.4 实验方法
    4.3 结果与分析
        4.3.1 不同短波长光质对野生型津田芜菁与突变体g142w的幼苗花青素合成模式分析
        4.3.2 HPLC分析野生型津田芜菁与突变体g142w中花青素类化合物组成成分
2g142w群体的构建及遗传分析'>        4.3.3 突变体F₂g142w群体的构建及遗传分析
        4.3.4 高通量测序数据质量控制及数据分析
        4.3.5 MutMap分析
        4.3.6 突变候选基因注释
        4.3.7 HRM技术验证候选SNP位点
        4.3.8 基于SNP的CAPs标记的开发
        4.3.9 筛选鉴定的候选基因功能注释
        4.3.10 候选基因区域转录FPKM表达值（来自转录组RNA-Seq数据）及RT-qPCR分析
    4.4 讨论
    4.5 本章小结
结论
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
附件

【参考文献】

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本文编号：2851765