凡纳滨对虾NADPH（NOX）基因的克隆及功能分析

发布时间：2020-10-23 01:38

　　 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是海水对虾养殖中的三大经济产品之一,但是对虾病害和恶劣的天气,是养殖户无法避免的难题,给水产养殖业造成了重大的经济损失。对虾病害是养殖业的最主要的威胁。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸是细胞抗氧化防御系统中的重要组成之一,在细胞防御活性氧损伤方面发挥着重要作用。NOX基因既可以指NADPH氧化酶,也可以指非吞噬细胞氧化酶。可通过抑制NOX基因来调节活性氧产生,使机体处于健康水平。因此,加强对对虾的非特异性免疫系统的研究是解决问题的关键,以预防为主,治疗为辅来防治病害。本文用凡纳滨对虾作为该研究的实验材料,进行NOX基因的相关研究。利用兼并引物、同源性克隆的方法及RACE技术,克隆获得凡纳滨对虾NOX基因的c DNA全长。使用q PCR的方法检测NOX基因在凡纳滨对虾中组织分布情况。用针戳凡纳滨对虾腹部血窦为外界刺激,注射PBS为阳性对照,注射ds RNA-RFP为阴性对照,实验组注射ds RNA-NOX,分别在0h、3h、6h、12h、24h、48h时间点取肌肉,通过q PCR检测NOX的变化;取处理后活虾虾血加入探针,使用酶标仪检测ROS的变化。结果显示,凡纳滨对虾NOX基因全长3792 bp,包含3006 bp的开放阅读框,其中5’非编码区为454 bp,3’非编码区为332 bp。NOX基因编码了1001个氨基酸,预测其分子量为11.51374 k Da,理论等电点为8.63。功能结构域位置815-990 aa。组织分布结果表明,NOX基因在眼柄、鳃、肝胰腺、心、胃、肌肉、肠、血、内表皮中均有分布,主要分布在肌肉、内表皮、眼柄、肝胰腺和血淋巴中,胃、心、鳃、肠有少量表达。经过外伤刺激后NOX基因产生了应答,采用RNAi技术抑制NOX基因的表达。结果表明,当NOX基因的转录表达受到抑制时,对虾虾血的ROS产量也受到了抑制,这说明NOX基因参与凡纳滨对虾的先天免疫防御,NOX基因表达量和活性氧的产量成正比例关系。
【学位单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

东海洋大学硕士学位论文 3’RACE 模版NA，操作参照 2.1.2.1。使5，OD260：OD230 为 2.01琼脂糖电泳检测，总 RNA 的量较好（图 2-1）适合做 RA2

verse Transcriptase (100 U) tal Volume aster Mix 8.0 μl 分 别 加 入 5中000rpm 离心 10 秒,使液体到管底0℃ 10min。-EDTABuffer 稀释 RACE 模版’端模版，放于-20℃备用。H（NOX）5’端克隆 5’RACE 模板，和引物（R5、R 后获得目的条带，约为 300bp 后，送公司测序，通过 NCBI 和琼脂糖电泳检测如下图（2-2） bp

TM℃ 3072℃ 3 m72℃ 10 m4 ℃ 保0 次，退火温度 TM 值根据引物泳检测。化、送测序。操作参照 2.1.2.6 实PH（NOX）3’端克隆 3’RACE 模板，和引物（F5、F 后获得目的条带，约为 700bp（公司测序，通过 NCBI 和基因组糖电泳检测如下图（2-3）。
【参考文献】

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本文编号：2852378