蒺藜苜蓿HMA5基因在共生固氮过程中的功能研究

发布时间：2020-10-25 00:50

　　 重金属转运蛋白P-type ATPase(HMA)已被证实参与植物体内的重金属运输,HMA5主要参与铜的转运。在模式植物拟南芥、水稻和黄瓜中对HMA5基因进行了较多的研究,但是对豆科植物HMA5的研究鲜见报道。实验室前期在天蓝苜蓿中分离到一个与铜胁迫及共生结瘤相关的HMA5基因,为了对此类基因在豆科植物共生结瘤中的作用进行深入研究,本研究对全基因组已测序的模式豆科植物蒺藜苜蓿的基因组进行筛查,寻找HMA5同源基因并通过表达模式分析初步判断其与共生结瘤的关系,在此基础上,以其中的MTR_8g079250基因为对象,进行亚细胞定位、组织表达、RNA干扰和过量表达等研究,初步鉴定该基因在共生结瘤中的功能。1、MTR_8g079250的亚细胞定位构建MTR_8g079250的洋葱表皮亚细胞定位载体,通过基因枪轰击转化洋葱表皮细胞,在激光共聚焦显微镜下观察到MTR_8g079250::GFP融合蛋白主要在细胞膜上表达,在细胞核上也有微量的表达;构建MTR_8g079250的烟草叶片亚细胞定位载体,通过根癌农杆菌介导注射烟草叶片的方式进行转化,结果表明目的基因主要定位在细胞膜和细胞核上;2、MTR_8g079250的组织表达构建PMTR_8g079250::GUS融合表达载体,通过农杆菌发根转化的方式转入蒺藜苜蓿根部,经培养后,进行GUS染色观察。结果表明目的基因主要在蒺藜苜蓿根瘤的分生区、侵染区以及皮层表达,在根的中柱和根冠表达。3、MTR_8g079250基因RNA干扰和过量表达转化植株的生长及结瘤情况分析构建目的基因的RNA干扰载体和过量表达载体,通过农杆菌发根转化的方式转入蒺藜苜蓿根部,形成转基因的嵌合植株。分别从根瘤菌的侵染事件、植株的形态生理指标、根瘤的显微结构和相关基因的时空表达等方面进行分析,RNA干扰转化植株在以上几个方面与对照组植株无明显差异,表明目的基因干扰后对根瘤菌的共生固氮没有产生明显影响。过量表达转化植株在根瘤菌侵染过程中形成的皮层侵染线和根瘤原基数目显著减少,植株鲜重和根瘤数目较对照组明显降低;透射电镜结果显示,根瘤受侵染细胞中类菌体数目减少,形状不规则,环类菌体空间增大,呈现出衰老的迹象;qRT-PCR分析表明,结瘤标志性基因NIN、DMI1和ENOD11的表达水平均有不同程度的下调,豆血红蛋白基因的表达水平也有所下调,蒺藜苜蓿HMA5另外两个同源基因MTR_5g010420和MTR_8g012390变化水平较小,HMA7/RAN1同源基因MTR_2g035840的表达水平显著上调,另一个基因MTR_4g094695的表达水平则无明显变化。CCH同源基因的表达水平无明显变化。综上所述,推测MTR_8g079250过量表达对共生结瘤有抑制作用,同时影响了植物的生长。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q943.2
【部分图文】：

结瘤因子诱导的信号转导途径（以豆科模式植物为例）（丑敏霞Signaling transduction pathways induced by nod factor (with M.trunc中 属离子的转运关于根瘤中金属离子转运的研究已开展，对于 Fe 的转运对于其他金属，例如 Mo、Ni 和 Cu 的研究还处于初级阶主要通过维管组织进行转运 (Gonzálezguerrero et al. 2016S-XRF 技术对根瘤不同发育阶段铁离子的分布研究，结果有检测到铁离子；在侵染区，铁离子积累在质外体中；固中；在衰亡区，侵染细胞中的铁离子浓度较固氮区侵染细微管组织中。根瘤的侵染区存在 Fe2+的转运体(Tejada-Jim有可能是通过柠檬酸盐进行转运(Takanashi et al. 2013)。tNramp1 负责将铁离子转运到侵染区细胞，并且 MtNram(Tejada-Jiménez et al. 2015)。根瘤中金属穿过共生体膜后终这些金属会转运到细胞质以发挥功能。Mo 是以钼酸根中(Cheng et al. 2016)。成熟根瘤中的氢化酶需要 Ni2+作为

12 蒺藜苜蓿 HMA5 基因在共生固氮过程中的功能研究2.4 结果与分析2.4.1 系统发育分析以目前分类明确的 HMA 家族基因为依据，对蒺藜苜蓿中的相关基因进行系统分析。选用系统进化分析软件 MEGA6，用最大似然法构建系统发育树，结果如所示。从图中可以看出蒺藜苜蓿中的 MTR_8g079250、MTR_5g010420 和 MTR_8g0与其他物种的 HMA5 家族基因相似性最高，预测这三个基因属于蒺藜苜蓿 HMA5

第二章 基因的选取及时空表达分析 13升高；MTR_5g010420 表达较稳定，其转录水平受到接种根瘤菌的显著诱导，接菌后 28d的表达量最高；MTR_8g012390 表达量在中期较高，接菌后 10d 达到峰值，但与未接种对照相比没有太大差异，只在接菌后 28d 时表达量较不接菌植株显著上调。根据以上结果分析，MTR_5g010420 和 MTR_8g079250 接菌后的表达量上调明显，预测与共生相关。
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 丑敏霞;魏新元;;豆科植物共生结瘤的分子基础和调控研究进展[J];植物生态学报;2010年07期

2 赵艳;徐迎春;柴翠翠;周燕;;铜胁迫对狭叶香蒲生长及生理特性的影响[J];广西植物;2010年03期

本文编号：2855211