TBX5基因启动子在心肌梗死病人中遗传和功能变异研究

发布时间：2020-10-24 23:18

　　 研究背景:急性心肌梗死(AMI)是冠心病的一个重要分型。随着社会发展和老龄化的加快,我国心血管病(CVD)的死亡率和患病率仍在快速增长。其中冠状动脉性心脏病(CAD)在心血管病中高发,绝大多数是由冠状动脉硬化引起的。根据流行病学研究已知,与冠状动脉硬化相关的重要危险因子有血脂异常、高血压、糖尿病、吸烟、肥胖、血同型半胱氨酸增高、体力活动少、高龄和男性等。冠心病的发生与周围环境和遗传因素有密切相关的联系。目前证实全基因组关联研究(GWAS)发现有200多个与CAD有关的染色体基因位点,但仅解释了只有11%的CAD与遗传相关。T-box基因编码在人类中已经鉴定出20多个基因,其中TBX5基因已经证实与心脏发育有关,同时对冠状动脉的形成也有一定影响。基因启动子对转录水平有调控的作用,进一步影响蛋白的翻译及表达。本研究我们推测表观遗传基因TBX5在AMI的发病机制中存在重要作用,通过对TBX5基因启动子的研究,探讨TBX5基因在转录水平上与AMI发生的关系。研究目的:通过分析发现冠心病的发生与基因遗传有密切关系。使用生物信息学方法来预测分析TBX5基因启动子区,通过设计引物克隆鉴定TBX5基因启动子。然后测序发现遗传变异位点,在此基础上,构建TBX5基因启动子野生型和遗传位点启动子的pGL3-basic报告基因载体,探讨遗传变异对转录水平的活性影响。然后运用EMSA实验方法进一步探讨有转录水平影响的遗传变异对转录调控的改变。本研究对TBX5基因启动子的遗传和功能变异提供了重要的实验依据。研究方法:1、本实验纳入新发AMI患者432例、同时间段健康体检人群448例,录入两组人群的临床基线资料,收集所有样本的外周血并提取全基因组。2、采用生物信息学预测TBX5基因启动子,根据NCBI基因数据库提供的序列设计引物,用PCR方法扩增基因启动子,扩增产物送往公司测序后统计分析变异序列位点结果。3、将统计的具有TBX5基因启动子的变异序列位点及野生型目的基因片段构建pGL3-basic双荧光素酶报告基因质粒,经测序鉴定后,将pGL3-basic双荧光素酶报告基因质粒和内参pRL-TK质粒利用脂质体瞬转至HEK293细胞、H9c2心肌细胞。使用双荧光报告基因分析仪检测报告基因表达产物双荧光素酶的活性,以鉴定TBX5基因启动子变异序列对转录活性的影响。4、在对具有转录活性有影响的基因启动子变异序列位点做进一步探讨,采用凝胶电泳迁移实验方法(EMSA),通过设计野生型和具有序列变异位点的目的基因设计探针,验证是否转录因子发生变化,从而发现对转录调控元件的影响。研究结果:1、AMI组患者的年龄比正常对照组年龄要高,同时男性患病率更高。通过对比发现,AMI组甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)数值与正常对照组,P0.001差异有统计学意义。根据统计发现,AMI组的患者具有吸烟史、糖尿病史和高血压病史的比例高于正常对照组,P0.01差异具有统计学意义。2、经PCR扩增后测序发现14个DSVs,其中包括6个单核苷酸多态性位点(SNPs)。在AMI组中发现了 6个杂合DSVs,2个为SNPs:g.114408439GT(rs186960328)、g.114408862AG、g.114409193TC、g.114409076CA、g.114409249AG(rs564965932)和 g.114409343GA。未在正常对照组中发现以上变异位点。在正常对照组人群中发现4个新的DSVs,其中2个杂合 DSVs:g.114408539TC、g.114409294AG,一个杂合缺失 DSV:g.114408344delC,一个杂合插入 DSV:g.114408458insTAATAA。尚未在 AMI 患者中出现。在AMI组和正常对照组里同时发现了 4个单核苷酸多态性位点(SNPs):g.114408635(rs57820630)GA、g.114409208(rs183776658)GA、g.114409331(rs7957609)CT 和 g.114409337(rs79795050)GC。同时把两组间发生的频率做比较,其发生频率相似,没有统计学意义(P0.05)。3、构建TBX5基因启动子pGL3-basic双荧光报告基因载体,分别为pGL3-WT(野生型)、pGL3-114408439T、pGL3-114408862G、pGL3-114409193C、pGL3-114409076A、pGL3-114409249A、pGL3-114409343G、pGL3-114409294C、pGL3-114408344delC、pGL3-114408458insTAATAA、pGL3-114409208A(rs183776658)。经测序鉴定,其插入变异序列正确,成功构建重组质粒。4、利用脂质体瞬转到人胚肾细胞系(HEK293)和大鼠心肌细胞系(H9c2)上。转染HEK293细胞,在AMI组中发现3个DSVs可显著影响TBX5基因启动子的转录活性。DSVs g.114409193TC(P0.01)能显著降低TBX5基因启动子的转录活性;DSVs g.114408862AG(P0.01)、g.114409076CA(P0.01)可以增加TBX5基因启动子的转录活性。在对照组中发现的DSVs:g.114408334delC、g.114408458insTAATAA、g.114409294AG,没有发现其改变 TBX5 基因启动子的转录活性(P0.05)。同时在AMI和对照组中DSVs g.114409208GA(rs183776658)没有发现其改变启动子的转录活性。转染H9c2细胞检测DSVs的相对转录活性。在AMI中发现DSVs:g.114409193TC(P0.01)、g.114408862AG(P0.01)、g.114409076CA(P0.01)、g.114409249GA(rs564965932)(P0.01)、g.114409343AG(P0.05)都可以显著降低TBX5基因启动子的转录活性。同样在正常对照组人群中发现的DSVs的差异没有统计学意义(P0.05)。EMSA实验结果显示DSVsg.114408862中野生型探针中出现了明显的与蛋白结合形成的特异性条带,但标记的突变型探针中其特异性条带消失,其余DSVs未检出。我们推测TBX5基因启动子DSVs g.114408862改变了其原先的转录位点。研究结论:通过对TBX5基因启动子的遗传和功能性变异的研究,在AMI病人中发现序列变异位点对TBX5的转录活性和转录位点的结合可能会有影响,进而会导致其表达水平的变化,对进一步研究心肌梗死的发生提供了新的方向,同时为心肌梗死的治疗提供了潜在靶点。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R542.22
【部分图文】：

１２３４５６７８９????７５０ｂｐ??图１－２?ＴＢＸ５基因启动子ＰＣＲ扩增片段２?（６８８ｂｐ）。泳道９是Ｄ２０００?ｍａｋｅｒ，??泳道１？８是ＴＢＸ５基因启动子片段２的部分扩增产物。??ｇ．１１４４０８４５８ｉｎｓＴＡＡＴＡＡ??Ｓ．１１４４〇９２４９Ｇ＞Ａ?ｇ，１４４０８５３９Ｔ＞Ｃ??ｇ．１１４４０９３３７Ｃ＞Ｇ?ｇ．１１４４０９２０８Ｇ＞Ａ?ｎ?１１４４ｎＲ＾４Ｈｆｉｉｒ??ｇ．１１４４０８６３５Ｇ＞Ａ?ｇ．１１４４０８３３４ｄｅｌＣ??ｇ．１１４４０９１９３Ｔ＞Ｃ??ｇ．１１４４０８８６２Ａ＞Ｇ??ｊ??ｊ?ｉ?Ｌ?ｉ?ｊ??－８００?－６００?－４〇〇?－２〇〇?—??Ｅｘ〇ｎ１??ｇ．１１４４０９３４３Ａ＞Ｇ??ｇ．１１４４０９３３１Ｔ＞Ｃ?ｇ．１１４４０９０７６Ｃ＞Ａ?ｇ．１１４４０８４３９Ｇ＞Ｔ??ｇ．１１４４０９２９４Ａ＞Ｇ??图２正常对照组和ＡＭＩ组的ＴＢＸ５基因（ＮＣＢＩ收录号：ＮＣ＿００００１２．１２）启动??子的ＤＳＶｓ位置。ＴＳＳ位于第一外显子起始位点ｇ．?１１４４０８４４１?（＋１）。??５３??

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图２正常对照组和ＡＭＩ组的ＴＢＸ５基因（ＮＣＢＩ收录号：ＮＣ＿００００１２．１２）启动??子的ＤＳＶｓ位置。ＴＳＳ位于第一外显子起始位点ｇ．?１１４４０８４４１?（＋１）。??
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 杨英;鲁向锋;;冠心病全基因组关联研究进展[J];遗传;2010年02期

本文编号：2855115