甜瓜ACS基因家族成员的鉴定及CmACS7和CmACS11的克隆与遗传转化

发布时间：2020-10-24 11:15

　　 甜瓜(Cucumis melo L.)为一年生匍匐或攀援草本植物,是重要的园艺经济作物,在世界上广泛栽培,它具有独特的生物特性和重要的经济价值。甜瓜是除了番茄之外另一种可选择且非常重要的研究肉质型果实发育的模式植物,乙烯在其果实发育成熟中存在着明显的变化。ACC合成酶(1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶,ACS)是乙烯生物合成过程中催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)的关键限速酶。以甜瓜品种河套蜜瓜(Cucumis melo L.cv.Hetao)为实验材料,应用生物信息学的方法从其基因组数据库中鉴定筛选出ACS基因家族的全部成员,共鉴定得到11个甜瓜ACS基因。内含子-外显子结构和系统发生与进化关系分析结果表明,甜瓜ACS基因中,CmACS1和CmACS2属于Ⅰ型,CmACS7、CmACS10、CmACS11和CmACS12属于Ⅱ型,CmACS3和CmACS5属于Ⅲ型。启动子预测结果显示,甜瓜ACS基因启动子序列中,主要含有参与防御和胁迫响应的顺式作用元件和参与响应各种激素的顺式调控元件。半定量和实时荧光定量检测结果表明,甜瓜ACS基因表达具有组织特异性,CmACS1和CmACS11在果实跃变期表达量升高,CmACS10和CmACS12在叶中表达量较高,CmACS7和CmACS11在子房中表达量均相对较高。应用RT-PCR法克隆了CmACS7和CmACS11基因全长cDNA,并分别构建CmACS7、CmACS11和实验室已克隆基因CmACS1的超表达载体和CRISPR/Cas9基因编辑载体。应用子房注射法转化甜瓜,PCR检测显示转化效率为12.5%-57%。通过测序分析,编辑载体pCRI-CmACS1、pCRI-CmACS7转化的阳性植株没有发生基因编辑,pCRI-CmACS11、pCRI-CmACS1/11和pCRI-CmACS7/11转化的阳性植株共有11株发生了基因编辑。
【学位单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q943.2;S652
【文章目录】：
摘要
abstract
一 引言
    1.1 甜瓜简介
        1.1.1 甜瓜的基本特性
        1.1.2 甜瓜基因组学研究进展
    1.2 ACC合成酶的研究进展
        1.2.1 ACC合成酶的生化特性及结构特征
        1.2.2 植物ACC合成酶进化分析
        1.2.3 植物ACC合成酶功能的研究进展
    1.3 基因组编辑技术的发展及应用前景
        1.3.1 基因组编辑技术概述
        1.3.2 基因组编辑技术的发展历程
    1.4 CRISPR/Cas系统概述
        1.4.1 CRISPR/Cas系统的研究历史
        1.4.2 CRISPR/Cas系统的分类
        1.4.3 CRISPR/Cas9系统的工作原理
        1.4.4 CRISPR/Cas9系统在植物中的研究进展
    1.5 本研究目的及意义
二 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 菌种与质粒
    2.2 方法
        2.2.1 甜瓜ACS基因家族成员的鉴定
        2.2.2 生物信息学分析
        2.2.3 ACS基因家族成员的表达特性分析
        2.2.4 CmACS7和CmACS11基因全长cDNA的RT-PCR扩增
        2.2.5 连接及转化
        2.2.6 CRISPR-Cas9载体的构建
        2.2.7 超表达载体的构建
        2.2.8 甜瓜的遗传转化
1代转化植株的检测'>        2.2.9 T₁代转化植株的检测
三 结果与分析
    3.1 甜瓜ACS基因家族成员的鉴定与分析
        3.1.1 序列比对及系统发生分析
        3.1.2 甜瓜ACS基因家族成员的基因结构分析
        3.1.3 甜瓜ACS基因家族启动子序列分析
    3.2 ACS基因家族成员的表达特性分析
    3.3 CmACS7和CmACS11基因全长cDNA的克隆
    3.4 基因编辑载体的构建
        3.4.1 基因组靶位点选择和接头引物设计
        3.4.2 gRNA表达盒的构建
        3.4.3 pCRI-ACS重组质粒的筛选
    3.5 超表达载体的构建
        3.5.1 重组质粒的PCR鉴定
        3.5.2 重组质粒的酶切鉴定
    3.6 ACS基因遗传转化及转基因植株检测
        3.6.1 甜瓜的遗传转化
1代转化植株的检测'>        3.6.2 T₁代转化植株的检测
四 讨论
    4.1 ACS基因家族成员的鉴定与分析
    4.2 CRISPR/Cas9技术对CmACS7和CmACS11基因的初步应用
五 结论
参考文献
在读期间发表论文情况
致谢
附录

【参考文献】

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本文编号：2854389