缺氧诱导microRNA-224靶向调控RASSF8基因在胃癌增殖、侵袭、转移过程中的作用及其机制的研究

发布时间：2020-10-29 10:26

　　 背景:胃癌是源自胃黏膜上皮的恶性肿瘤。在世界癌症相关的死亡率中,胃癌位居第三位。每年我国占全世界的42%的胃癌检出总数,达到40万例/年,死亡人数达到30万左右。虽然目前内镜技术、外科手术、放疗和化疗技术已经取得了相当程度的进步,但我国中晚期胃癌病人的五年总生存率不到30%,尤其是晚期胃癌病人的预后差。因此,进一步研究胃癌发病机理中潜在的分子机制并寻找新的治疗靶点显得尤为重要。在中晚期胃癌患者中,肿瘤细胞的快速增殖可导致细胞内的氧耗增加,瘤体内血管结构和功能的异常也可导致肿瘤细胞内血液供应和氧供应减少,这都造成了肿瘤细胞的缺氧。缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor,HIF-1)是目前研究发现的在缺氧状态下发挥活性的特异性的关键转录因子,HIF-1能在缺氧状态中连接上下游基因的激活。HIF-1以异源二聚体形式广泛存在于哺乳动物和人体内,主要由HIF-1α和HIF-1β两个亚基组成,其中HIF-1α是活性亚基。有大量研究表明,HIF-1α过表达与胃癌的发生、发展过程密切相关。同时研究发现HIF-1α与血管内皮生长因子(VEGF)的表达,肿瘤的分化、浸润、转移及分期有关。因此,HIF-1α的表达高低与胃癌的浸润、转移具有一定的关系,但其作用机理尚不明确。近年研究表明,HIF-1α不仅能调控多种细胞增殖、侵袭、能量代谢等相关基因,如促红细胞生成素(EPO)编码基因、VEGF编码基因、内皮素、血小板源性生长因子等,同时能够调控细胞内氧化还原稳态、铁代谢、线粒体代谢物、多种生长因子以及小分子核糖核酸(microRNA,mi RNA)等。mi RNA是一种长度约22个核苷酸的内源性非编码RNA分子,在转录后水平调节基因的表达。通过碱基互补配对原则,mi RNA特异性结合靶基因mRNA的3′非编码区。根据互补程度的不同,抑制靶基因的翻译或导致靶基因mRNA降解,实现对转录后表达的调控。研究表明,miRNA在细胞的发育、凋亡、增殖和分化等生命过程中发挥重要作用。其中,miR-224被证实在肝癌中高表达,并且在黑色素瘤细胞中HIF-1α能够促进mi R-224的表达。然而,在胃癌中,缺氧及HIF-1α是否能够调节miR-224的表达,以及miR-224是胃癌的发生发展中所起的作用目前尚不明确。本论文通过研究缺氧及HIF-1α诱导miR-224的表达以及miR-224对胃癌细胞增殖、侵袭、转移的作用,进一步阐明了miR-224在胃癌发生发展中的分子作用机制。目的:明确缺氧及HIF-1α诱导下的miR-224在胃癌细胞增殖、侵袭、转移中的分子作用机制。方法:在胃癌细胞中,通过实时荧光定量PCR和Northern免疫杂交实验对缺氧及HIF-1α诱导miR-224的表达进行了研究。使用荧光素酶报告系统和染色质免疫沉淀技术(ChIP)明确miR-224是否为HIF-1α的靶基因。再利用MTT、克隆形成实验、体外划痕和侵袭实验测定miR-224在缺氧状态下对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用,并在活体动物实验中进行同样的研究。利用荧光素酶报告基因系统和Western blot免疫印迹实验验证miR-224转录后调控的目标靶基因。通过功能研究以确定在缺氧条件下RASSF8对miR-224所起的作用。并分别使用荧光素酶报告基因系统和Western blot免疫印迹实验证实,RASSF8基因表达减少后,对NF-κB在转录活性和细胞内分布的影响。最后,使用实时荧光定量PCR检测miR-224和RASSF8在胃癌组织和淋巴结转移阳性的胃癌组织中的表达水平。结果:(1)缺氧和HIF-1α能够上调miR-224的表达。HIF-1α是在转录水平上影响miR-224的表达。缺氧条件下,如果抑制miR-224即可抑制胃癌细胞系的生长、迁移及侵袭,相反,如果miR-224过度表达则会促进胃癌细胞系的生长、迁移及侵袭。在动物体内实验中,抑制miR-224也有抑制肿瘤生长的作用。(2)确定了RASSF8基因是mi R-224的直接调控基因。过表达RASSF8能够抑制细胞的增殖和侵袭,沉默RASSF8基因则能减弱因抑制mi R-224而被抑制的细胞增殖和侵袭。进一步发现,沉默RASSF8,能够增强NF-κB的转录活性和p65质核移位,而RASSF8过度表达则相反。使用PDTC抑制NF-κB的活性削弱敲减RASSF8在细胞增殖和侵袭方面的作用。(3)MiR-224在胃癌组织及淋巴结转移阳性的胃癌组织中高表达,而RASSF8在上述组织中表达却减少。结论:缺氧诱导下,HIF-1α能够在转录水平上调miR-224的表达,而miR-224是通过下调RASSF8的表达来促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。RASSF8通过促进p65的亚细胞再分配来促进NF-κB的转录活性。这预示着抑制miR-224可能有潜力成为胃癌治疗的新靶点。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.2
【部分图文】：

图 2.1 缺氧条件下肿瘤细胞基质和成纤维细胞Fig. 2.1 Tumour stroma and extracellular matrix in hypoxia肿瘤导致癌症和远离血管的肿瘤基质细胞的氧供应减少。缺氧导致肿瘤微环质细胞的细胞因子表达，促进肿瘤生长。氧诱导因子（HIF-1）瘤的发生和发展过程中，大多数实体肿瘤均存在永久或瞬时缺氧。件下，主要通过缺氧诱导因子（hypoxia inducible factors，HIFs）基因进而保证自身存活，如肿瘤细胞可通过激活碳酸酐酶 9 的表 值[15]；上调葡萄糖转运蛋白 1（glucose transporter-1，GLUT-1）维持细胞内葡萄糖的含量[16]，并通过分泌 VEGF 或激活 TAp73（traotein 73）等基因来诱导血管的形成[17][18]，这些血管在结构上大都胞的远处转移提供了便利。

的活性调控区域，C 末端有一个富含脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸（Pro/Ser/Thr）的氧依赖降解 结 构 域 （ oxygen-dependent degradation domain ， ODD ） 和 反 式 激 活 结 构 域（transactivationdomain，TAD），即 TAD-C-N 末端含有 TAD-N；这些结构域都是缺氧诱导蛋白稳定、核定位和转录激活的调节域，其中 TAD-C 发挥精细调整作用，TAD-N为激活转录所必需，可见 HIF-1α 亚基受缺氧调控并调节 HIF-1 的活性。HIF-1β 亚基又称芳香烃受体核转运子（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT），基因定位于人的 1 号染色体 q21 区，HIF-1β 除了结构性组成作用外，其还可能与 HIF-1 在核内的稳定性及二聚化后的构象转变有关。有研究证明在 HIF-1β 亚基缺陷的细胞内不能诱导 HIF-1 的活性，HIF-1α 亚基必须与 HIF-1β 亚基聚合形成异二聚体，才能发挥转录因子的作用。2 个亚基的氨基端均含有碱性的螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helixdomain，bHLH）构型和 Per/Amt/Sim（PAS）结构，是其形成异源二聚体并与 DNA 结合所必需的结构，如图 2.2。

图 2.3 miRNA 产生过程Fig2.3 miRNA production processcroRNA 的生物学特性 年，Lee 等首次发现了 miRNA，其通过定点突变技术在线虫中发种小分子 RNA，而非蛋白质，随后，科学家们对 miRNA 展开了广特定的组织和阶段进行表达，与细胞类型和细胞分化阶段相关，序性，此种特性也决定了 miRNA 在生命的生长发育的多种过程中。 miRNA 可以通过部分互补结合到目的 mRNA 靶的 3’UTR，以一质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成，通过调控一组关键 mRNA 的育进程[29]。
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 秦承东;任正刚;汤钊猷;;缺氧微环境在肿瘤进展中的作用[J];肿瘤;2016年01期

2 Hui-Lin Ye;Dou-Dou Li;Qing Lin;Yu Zhou;Quan-Bo Zhou;Bing Zeng;Zhi-Qiang Fu;Wen-Chao Gao;Yi-Min Liu;Rui-Wan Chen;Zhi-Hua Li;Ru-Fu Chen;;Low RASSF6 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is associated with poor survival[J];World Journal of Gastroenterology;2015年21期

本文编号：2860776