银鲳温度胁迫差异基因及代谢相关同工酶的初步研究

发布时间：2020-10-29 09:54

　　 银鲳(Pampus argenteus)属鲈形目鲳亚目鲳科鲳属,为暖温性近海中下层鱼类,分布于印度洋、印度-太平洋区、朝鲜和日本西部海域,在中国沿海地区均有分布,是主要的捕捞鱼种之一,属名贵食用鱼类。银鲳这类水生变温动物来说,环境温度直接影响到其生长和生存,而且在实际养殖生产中,可能会因为气候的变化或人为因素等原因导致水温突变,形成急性温度胁迫。为应对外界复杂多变的环境,银鲳必须有一套高效的基因表达模式来应对温度的变化,从而控制生理及生化过程的正常进行。本文首次对银鲳肝组织进行转录组测序,对温度胁迫下银鲳转录组的De novo拼接和基因差异表达进行分析。本研究结果不仅对了解温度在银鲳基因表达中所起作用有很多帮助,还能为后人研究和人工养殖提供大量的数据基础和技术资料。同工酶在鱼类研究中较为广泛,通过对组织特异性的初步分析,能够为其种质资源、人工选育和遗传研究提供同工酶谱和生化遗传学的参考指标。本文首次对银鲳不同组织的多种同工酶的表达差异进行研究,以期了解不同种类同工酶在各组织中所起作用。1、温度胁迫下银鲳转录组的De novo拼接和基因差异表达的分析共得到338525690条Trim Reads,序列拼接共得到3715603条Unigene;比对数据库分析中,注释到Nr、Nt、Swisspro库中同源基因分别有136912条、143359条、104547条;1622071条Unigene分别注释到GO的生物过程、分子功能和细胞组成三个子类中,KEGG分析中52121条Unigene映射到338个代谢途径,60212条Unigene得到25个KOG分类注释。在32℃下,6h时与对照组(27℃处理0h)对比,获得431个差异表达基因,包括233个上调表达基因和198个下调表达基因,得到1041个GO显著富集,KEGG显著富集通路32个;12h时获得343个差异表达基因,包括143个上调表达基因和200下调表达基因,得到946个GO显著富集,KEGG显著富集通路21个。在22℃条件下,6h时与对照组对比,获得353个差异表达基因,包括179个上调表达基因和174个下调表达基因,得到1046个GO显著富集,KEGG显著富集通路22个;12h时获得1303个差异表达基因,包括1111个上调表达基因和193个下调表达基因,得到1132个GO显著富集,KEGG显著富集通路44个。2、银鲳RNA-seq数据中SSR标记的信息分析银鲳转录组水平上,共鉴定出107007个SSR位点,分布在97289条unigene中,发生频率为2.62%,SSR平均密度为476个/Mbp。在银鲳转录组的SSRs中,单核苷酸与二核苷酸重复序列为主要重复类型,分别占总SSRs的48.14%和34.10%。银鲳转录组数据中SSR序列共包括424种重复基元类型,单核苷酸重复基元A占主要,占同一重复类型SSRs的49.57%,二核苷酸重复基元TG/AC和三核苷酸重复基元GAG/AAC是优势重复基元,分别占同一重复类型SSRs的42.43%和9.61%。统计得到重复序列长度在12 bp以上的SSR标记位点数占总SSR数的76.95%,具有十分丰富的多态性。3、银鲳不同组织中4种同工酶的表达差异采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,分析了银鲳(Pampus argenteus)脾脏、肝脏、肌肉、心脏、肾脏等5种组织中酯酶(EST)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、乙醇脱氢酶(ADH)等4种同工酶的表达模式,并对各种同工酶的酶谱进行了分析。结果表明:这4种同工酶在银鲳5种组织中的分布均存在一定的组织特异性,其与各组织的生理机能密切相关。银鲳4种同工酶共记录出61条酶带,其中EST被检测出的酶带数量最多也较复杂,ADH同工酶酶带数量最少,只有6条酶带被检测到,LDH和GDH分别检测到16条和9条酶带。EST在肝和心组织中表达活性最强,其次是肌肉组织,肝和心脏中EST条带分布较均匀,肌肉中条带在EST6-EST12位点之间分布多于EST6位点之前;在银鲳肝脏组织中,共检测到5条酶带,活性强弱依据酶带深浅为LDH4LDH2LDH3LDH1LDH5,肾脏中清晰的检测到4条酶带,心脏中检测到3条酶带,肌肉和脾脏中仅检测到两条酶带;银鲳肾脏组织中检测到3条谷氨酸脱氢酶酶带,肝脏和心脏中检测到2条酶带,肌肉和脾脏组织中分别检测到1条酶带;银鲳肝脏组织中检测到2条乙醇脱氢酶酶带,其他四种组织中仅检测到一种类型酶带。组织特异性主要表现在位点表达和酶活性强弱不同这两个方面,比如:GDH1和ADH2只在肝脏中表达,EST在肝脏和心脏组织中活跃度高于其它组织,LDH1在银鲳肝脏组织中表达明显。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S917.4
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 转录组测序技术简介
    1.2 温度对鱼类繁殖和生长的影响
    1.3 SSR标记技术应用进展
    1.4 同工酶简介
    1.5 银鲳的相关研究进展及本研究的目的意义
第二章 温度胁迫下银鲳转录组的DE NOVO拼接和基因差异表达的分析
    2.1 材料和方法
    2.2 结果
        2.2.1 银鲳的 c DNA 序列分析与组装
        2.2.2 银鲳基因序列功能注释信息
        2.2.3 热胁迫处理实验组与对照组差异基因表达分析
            2.2.3.1 热胁迫处理实验组与对照组差异表达基因的GO功能富集结果
            2.2.3.2 热胁迫处理组与对照组差异表达基因的KEGG功能富集结果
        2.2.4 冷胁迫处理实验组与对照组差异基因表达分析
            2.2.4.1 冷胁迫处理实验组与对照组差异表达基因的GO功能富集结果
            2.2.4.2 冷胁迫处理实验组与对照组差异表达基因的KEGG功能富集结果
        2.2.5 差异表达基因层次聚类分析
    2.3 讨论
第三章 基于银鲳 RNA-seq 数据中 SSR 标记的信息分析
    3.1 材料与方法
        3.1.1 银鲳RNA提取及CDNA文库构建
        3.1.2 RNA测序及组装
        3.1.3 银鲳SSR标记筛选
        3.1.4 统计与分析
    3.2 结果与分析
        3.2.1 银鲳转录组中SSR位点的数量与分布信息
        3.2.2 银鲳转录组SSR的特点
        3.2.3 银鲳转录组SSR多态性评估
    3.3 讨论
第四章 银鲳不同组织中 4 种同工酶的表达差异
    4.1 材料与方法
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 酶液样品制备
        4.1.3 电泳方法
        4.1.4 染色及酶谱分析
    4.2 结果与分析
        4.2.1 EST
        4.2.2 LDH
        4.2.3 GDH
        4.2.4 ADH
    4.3 讨论
        4.3.1 银鲳同工酶表达的组织特异性
        4.3.2 银鲳不同组织同工酶表达的特异性及其与功能的关系
    4.4 小结
结论
参考文献
攻读学位期间发表的论文
致谢

【参考文献】

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本文编号：2860736