靶向TGF-β1的治疗性基因重组抗体药物研发及表征

发布时间：2020-10-31 04:35

　　 TGF-β(transforming growth factors-β,转化生长因子TGF-β)在肿瘤的发生以及发展过程中的作用极其复杂。体细胞基因突变所导致的对TGF-β的抑制增殖作用的破坏,是恶性肿瘤形成的关键因素。随之而来的是,这种对于TGF-β抑制增殖作用的脱敏,常常导致肿瘤细胞以及被招募到肿瘤微环境的正常细胞大量表达TGF-β细胞因子。有研究表明,在肿瘤微环境下一定浓度的TGF-β细胞因子会促进肿瘤生长以及转移的发生。因此,选择性抑制肿瘤细胞周围的表达上调的TGF-β,逐渐成为治疗TGF-β相关疾病的热门治疗策略。大量实验证据表明,在小鼠移植瘤模型中,使用靶向TGF-β的特异性抗体药物、可溶性受体以及针对TGF-β信号转导通路的小分子抑制剂可有效抑制肿瘤生长。在本研究中,我们基于已经披露部分信息的两个抗体:一个是RD公司的杂交瘤来源的1D11工具抗体;另一个是Eli Lilly公司的LY-2382770人源化抗体,来开发出具有独立知识产权的能有效结合hTGF-β1的单抗药物先导分子,验证它的抗肿瘤效果,并最终用于下一步与PD-1单抗组建双功能抗体或联合用药。在比较两个抗体的生物活性以及理化特性之后,我们发现1D11抗体的亲和力以及生物学活性均显著低于LY-2382770抗体,而且两者结合的抗原表位近似,但后者却存在热力学稳定性方面的不足。在综合考虑各方面因素以后,我们选择Eli Lilly公司的LY-2382770抗体作为抗体工程改造的优选分子。其次,考虑到抗体的Vh(重链可变区)基因在抗原识别的特异性方面占据主导作用,为了降低改造单抗对于TGF-β抗原的特异性识别能力的削弱,并且同时进行热稳定性改造,我们只对LY-2382770单抗进行轻链替换,并借此寻找热稳定性提高的突变体。实验结果表明,使用轻链替换能有效的提高抗体的热稳定性以及表达量,改善抗体的聚集情况,并且对抗体自身的亲和力不会产生明显的影响。配合使用亲和力成熟的方法可以弥补亲和力的降低,联合使用这两种方法可以加速先导分子的研发速度和研发效率。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R73-36
【部分图文】：

2.4.2 悬浮 HEK293F 细胞瞬转表达抗体蛋白的纯化与鉴定我们使用转染试剂 PEI（cationic polymer polyethylenimine）在 HEK293F 细胞中瞬转表达抗体 1D11 和 LY2382770，二氧化碳摇床中培养 7 天左右，当细胞的存活率达到 60%以下时，分两次离心，收集最终的上清液。在蛋白质层析纯化系统 AKTAPurifier 25 中，使用 ProteinA 亲和层析柱进行抗体的纯化工作。经过还原与非还原 SDS-PAGE 蛋白电泳之后，在还原状态下，一共出现两条带，一条为抗体重链，分子量为 50KD；另一条 25KD 的带为抗体轻链。在非还原状态下，我们发现 LY-2382770 抗体相比于 1D11 抗体有更多的聚集以及降解情图 1 LY-2382770 和 1D11 抗 体 质 粒 的 酶 切 验 证 。 1 、 3 分 别 为pCAT1.0/LY-2382770/Hc,pCAT2.0/LY-2382770/Lc 。 5 、 7 分 别 为pCAT1.0/1D11/Hc,pCAT2.0/1D11/Lc。2、4、6、8 为 Hind III 和 EcoR I 的酶切质粒。注：Hc，抗体重链。Lc，抗体轻链

2.4.3 HPLC-SEC 检测抗体的聚集以及降解情况我们使用 Thermo MabPac SEC-1（7.8*300mm）分子筛柱子，来检测 1D11和 LY2382770 两个抗体的聚集以及降解情况。工作原理：分析物分子量越大的出峰时间越早，或者说滞留时间越短；分子量越小的出峰越晚，或者说滞留时间越长；而完整抗体单体的出峰时间大约在 6.5~6.8min 之间。HPLC-SEC 的检测结果显示 LY-2382770 抗体成分复杂，单体的有效积分面积约占总体的72.9604%，而 1D11 抗体单体的有效积分面积约占总体的 91.1021%。相比于 1D11抗体，LY-2382770 抗体的聚集以及降解情况更为严重，并且与 SDS-PAGE 的结图 2 LY-2382770 和 1D11 抗体纯化 SDS-PAGE 胶图。 native 和 denatured 状态下，检测 LY-2382770 和 1D11 抗体的聚集情况。1、2 分别为 LY-2382770 抗体的非还原与还原状态胶图，3、4 分别为 1D11 抗体的非还原与还原状态胶图。注：native，非还原。denatured，非还原。

312.4.4 DSC 差示扫描量热法检测抗体热稳定性从 20°C 到 110°C，以恒定的加热速度 1°C /min 进行扫描，随着抗体去折叠，抗体样品吸收热量，而消除样品池温差所需要的补充能量则通过 DSC 设备记录下来。这些记录就形成了我们所见到的热力学曲线，当 50%的抗体发生去折叠图 3 基于 HPLC-SEC 检测抗体单体成分。（A）LY-2382770 抗体的 SEC 峰图，LY-2382770 抗体成分复杂，单体只占 72.9604%。（B）1D11 抗体单体成分约占91.1021%。
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本文编号：2863453