KCTD基因家族进化分析及kctd基因斑马鱼突变体的构建

发布时间：2020-11-01 06:19

　　近年来,类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)、锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease,ZFN)及成簇的规律性间隔短回文重复序列及相关核酸内切酶(CRISPR/Cas9,Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)等基因编辑技术得到快速发展并用于各种基因组的编辑。其中,CRISPR-Cas9技术以简单高效的特点得到了广泛的应用。利用CRISPR/Cas9系统构建动物疾病模型在研究人类疾病致病机理和药物筛选中有重要意义。钾离子通道四聚化结构域(potassium channel tetramerization domain,KCTD)蛋白基因家族是一个保守的基因家族,该家族成员的共同特征是具有一个含有BTB(Bric-a-brack,Tram-track,Broad complex)保守结构域的N-末端和一个可变的C-末端。KCTD基因家族从无脊椎动物到脊椎动物广泛存在,无脊椎动物线虫中仅有5个成员,果蝇中有8个成员,而在脊椎动物小鼠和人类中有24个成员。KCTD参与的生物过程包括转录抑制、细胞骨架调控等,其蛋白质在增殖、分化、凋亡、代谢中担任重要角色。KCTD基因的突变或不正常调控与人类多种疾病相关。七鳃鳗是目前存在的最古老的脊椎动物,是联系无脊椎动物和脊椎动物之间的桥梁,在生物进化研究中发挥无可替代的作用。与两栖类相似,七鳃鳗生活史中也有一个像蝌蚪变成青蛙的变态过程(metamorphosis),有研究将七鳃鳗的变态过程划分为七个阶段(M1-M7)。目前,已有海七鳃鳗(Petromyzon marinus)和日本七鳃鳗(Lethenteron japonicum)2个物种的基因组被解析,这些信息对于我们研究基因和基因家族的起源和进化都具有重要的意义。本研究通过对海七鳃鳗和日本七鳃鳗基因组和转录组数据分析,全面系统地鉴定了海七鳃鳗和日本七鳃鳗kctd基因家族成员,并对其基因结构特征、蛋白保守基序和基因表达模式进行了分析。在海七鳃鳗和日本七鳃鳗中分别鉴定出13和14个kctd基因,基因长度和外显子数目在不同kctd基因间变化很大,Kctd蛋白中4个基序保守性显著,大多数kctd基因呈泛表达模式,并且在胚胎发育时期明显高表达。除七鳃鳗外,对12个无脊椎动物和脊椎动物代表物种kctd基因家族成员进行了鉴定,并对kctd基因家族成员的进化关系进行了分析。根据进化树聚类情况,将kctd基因家族成员分为10个亚家族。进化分析显示,kctd基因家族从低等的无脊椎动物线虫和果蝇到高等的人类都存在;线虫中仅有5个成员,果蝇中有8个成员,随着物种进化程度由低到高,kctd家族成员数目呈现增加的趋势;从爬行类开始,脊椎动物kctd基因数目稳定在24个左右。硬骨鱼类特有的全基因组复制事件影响鱼类kctd基因数目。本研究结果不仅丰富了七鳃鳗kctd基因家族信息,同时也对kctd家族基因间的进化关系进行了探究,为深入研究该家族基因功能奠定了基础。利用CRISPR/Cas9技术实现了对斑马鱼kctd基因家族中4个基因,即kctd3、kctd7、kctd8和kctd14的成功敲除,并希望能够通过对所获得的4个基因的纯合突变体进行基因功能的初步研究。在F0时,对定点敲除的kctd3、kctd7、kctd8和kctd14进行敲除效率的统计,所敲除的4个基因的突变效率都在30%-90%之间。在kctd纯合突变体的筛选中,符合孟德尔遗传定律。本次斑马鱼kctd基因突变体的构建中,获得两种类型kctd3纯合突变体,分别为-11bp和-20bp;kctd7纯合突变体为+19bp和-19bp两种类型;以及+13bp的kctd8纯合突变类型和-8bp的kctd14纯合突变类型。通过半定量RT-PCR技术以β-actin作为内参对成鱼的不同组织(腮、皮肤、眼睛、卵巢/精巢、心脏、肌肉、肝脏、肾、脾和脑)和不同发育阶段(1天、2天、3天、5天、10天、20天、30天、45天和60天)斑马鱼的kctd3、kctd7、kctd8和kctd14基因的时空表达模式进行初步的分析。从量化数据可以看出,kctd3和kctd7在各个组织中均表现出高表达,kctd8和kctd14的表达表现出明显的组织特异性,kctd8在眼睛、精巢和脑中的表达水平高,kctd14在卵巢、肌肉和肾中的表达高。kctd3、kctd7、kctd8和kctd14在斑马鱼的不同发育阶段的表达特点相似,均表现出,在第3天表达较第1天和第2天显著升高,在第5天到第45天表达量较第1天和第2天明显升高,但在45天之后表达量又出现了下降的趋势,表现出特异性。这些结果对于进一步分析kctd基因的功能和了解人类KCTD基因突变导致的某些疾病的发病机理,对于人类疾病的预防、诊断和治疗具有积极的意义。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q78
【部分图文】：

细菌体,机制,正向重复序列,基因座

第一章引言RISPR/Cas9 基因编辑技术CRISPR/Cas9 的作用机制簇的规律性间隔短回文重复序列及相关核酸内切酶（CRISPR/Cas9，Clarly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins），和古细菌的免疫防御系统[1]。CRISPR/Cas 基因座有三部分构成，包括RNA 基因；中间 Cas 编码基因；3' 端由正向重复序列和间隔序列按成的 CRISPR 基因座，以及位于第一个正向重复序列上游的引导序列PR/Cas9 的作用机制有三个步构成，如下图所示（图 1-1）。

细菌,编辑系统,基因,定点修饰

图 1-2 细菌中三种不同类型的 CRISPR 系统[2]。Fig 1-2 The diagram of three different type of CRISPR system in bacteria.CRISPR/Cas9 系统的应用RISPR/Cas9 系统相比于 ZFN 和 TALEN 更加简单，该系统对靶位点进行仅需要 Cas9 核酸内切酶和两段 RNA 就可以。并且有研究发现，通过 4 个这两段 RNA 连接起来就可以和 Cas9 形成复合物并可以在体外对特定的进行切割[15]。前，CRISPR/Cas9 的 TypeⅡ型系统是被应用最广泛的一种系统，此系统人类的细胞中、小鼠和斑马鱼中成功实现了基因组定点修饰[16-18]。2013 年g 和 MIT 的课题组首次报道了利用 CRISPR/Cas9 基因编辑系统实现了对中的 PVALB 和 EMX1 两个基因和小鼠细胞中的 Th 基因定点突变[18]。到现在为止，CRISPR/Cas9 基因编辑系统的应用越来越广泛，其介导的基

KCTD基因家族进化分析及kctd基因斑马鱼突变体的构建