水稻OsMY1基因的克隆及功能的初步鉴定

发布时间：2020-11-03 03:23

　　 OsMY1(GenBank DQ641916)基因是本实验室前期通过酵母双杂交筛选,从水稻雌雄蕊形成期幼穗cDNA库中分离得到的功能未知基因。序列分析显示,该基因cDNA编码区的5'端不完整。本研究拟克隆该基因全长cDNA序列,并利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,构建OsMY1基因敲除水稻,同时以实验室前期构建的OsMY1基因RNAi水稻T1代为材料开展研究,旨在明确该基因在水稻生长发育中的功能。为了获得OsMY1基因的5′端序列,采用5′-RACE结合RT-PCR技术,从水稻的幼穗组织中克隆该基因全长cDNA序列。首先通过5′-RACE获得其5'端序列,与原3′端序列拼接后,得到全长为1953bp的OsMY1基因cDNA序列,据此设计引物,通过RT-PCR扩增其cDNA序列。测序结果显示,OsMY1基因cDNA序列中包含一个1140bp的ORF,编码379个氨基酸。生物信息学分析显示,OsMY1蛋白中仅含有两个保守的CC结构域,属于水稻ICR蛋白,OsMY1与短花药野生稻的ICR序列具有90.7%的同源性。为了分析OsMY1基因在水稻中的表达模式,采用qRT-PCR技术,检测水稻不同发育阶段:幼苗期(根、叶)、分蘖期(根、叶)、幼穗分化期8个阶段中OsMY1基因的表达水平。发现OsMY1在幼苗期的叶比在根中的表达量高,在分蘖期的根中比在叶中表达量高,而抽穗期的幼穗中,OsMY1的表达水平明显比其他两个发育时期的表达水平高,其中在颖花长度3-5mm的幼穗中表达量最高。为了鉴定水稻OsMY1基因的功能,利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术构建基因敲除水稻。通过序列比对,筛选了两个编辑靶点,进而构建了CRISPR/Cas9植物表达载体。以日本晴水稻为材料,利用农杆菌介导法,对水稻愈伤组织进行遗传转化,并获得再生植株。经潮霉素抗性基因筛选及PCR靶位点分子测序检测,证实获得了2个纯合敲除水稻株系(Cas9-OsMY1)。对Cas9-OsMY1水稻T1代进行农艺学性状统计,结果表明,敲除水稻与对照相比,株高极显著降低,平均减小5.3%;穗长极显著增加,平均增加18.6%,但是在有效分蘖数、穗实粒数,结实率,千粒重等农艺学性状上均无明显差异。对实验室前期构建的OsMY1基因RNAi水稻(RNAi-OsMY1)进行T2和T3代的连续筛选和鉴定,获得6个OsMY1基因表达量下调的株系。对RNAi-OsMY1水稻表型观察发现,与对照相比,在幼苗期和生殖生长阶段,RNAi水稻株高均极显著降低。农艺性状统计表明,株高、穗长、结实率和千粒重均极显著降低,其中株高平均减小21.25%,穗长平均降低17.1%,结实率平均降低10.5%,千粒重平均降低13.24%。为了探究OsMY1基因RNAi水稻和敲除水稻株高降低的原因,利用qRT-PCR技术,检测了赤霉素(GA)合成途径以及信号传递途径8个相关基因在叶片中的表达,发现无论在RNAi水稻还是敲除水稻中,赤霉素合成基因(OsCPS、OsKO2、OsKAO)和信号正向调控传导基因(OsGID1、OsGID2)与对照相比表达量均下调,而负调控信号传导基因OsSLR1与对照相比表达量上调。本文基于实验室的前期工作基础,通过5′-RACE结合RT-PCR技术,克隆了OsMY1基因的全长cDNA序列,并通过序列比对分析,明确了该基因属于水稻ICR蛋白。分别采用RNAi和CRISPR/Cas9基因组编辑技术对该基因开展功能鉴定,证实该基因被敲除或者表达被抑制都导致水稻株高降低。为解析转基因水稻株高降低的分子机制,以GA信号通路为切入点,证明了株高降低的原因在于GA合成途径以及信号传递途径关键基因表达水平下调,为后续深入研究OsMY1基因在水稻株高性状控制中的功能奠定了基础,同时也为水稻矮化分子育种提供了新的潜在的候选基因。
【学位单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S511;Q943.2
【部分图文】：

而 GA3和 GA7是与 GA1和 GA4相比具有较少丰度的含双键的 GAs[29]。赤霉素的生物代谢通路可分为三个步骤进行[30-33]如图 1-1，第一步发生在质P 是 GAs 的前一阶段的物质，在古巴焦磷酸生成酶（ent-copalyl diphosphate sy和内根-贝壳杉稀生成酶（ent-kaurene synthase KS）共同催化下合成内根见t-Kaurene）；第二步在植物内质网上催化发生：第一步的生成物中 C19的 CH氧化，催化酶为内根-贝壳杉烯氧化蛋白（ent-kaurene oxidase KO），先后合成杉稀醇（ent-kaurenol）、内根-贝壳杉稀醛（ent-kaurenal）和内根-贝壳杉t-kaurenoic acid）。第三步 C-7ɑ 通过内根-贝壳杉烯酸氧化蛋白（ent-kaurenose KAO）三次去氢反应合成了内根-7ɑ-羟基贝壳杉烯酸 CA12-醛。CA12-醛进A12/CA53；在细胞质基质中生成 GA：CA12和 CA53运送至细胞质基质后，C酶（CA20ox、CA3ox、CA2ox）氧化成对应的有活性的 GAs[32,34-36]。

图 1-2 植物体内 GA 信号传导途径（注：引自 Jean-Michel Davière 等[55]）水稻中与 GA 信号传递相关的株高基因，见附录 A 表 A-2。早先研究的水稻变异体 d1 对 GA 不敏感，对它喷洒外源赤霉素无响应，但内源赤的含量高于野生型。D1 基因调控 GTP 结合蛋白的 α 亚基的生成，表明 GTP 结合蛋响赤霉素信号传递[56]。矮秆基因 gid1[19]和 gid2[57]、高秆基因 slr1[21]都参与赤霉素的信号传递。gid1(gibberellin insensitive dwarf1)是 GA 不灵敏变异体，GID1 调控可溶的 GA 结合能特异地结合有生物学效应的 GAs[19]，有生物学效应的 GAs 可能与 GID1 亲和后够与 SLR1 结合，变成 GID1-GA-SLR1 多聚体，SCFGID2多聚体泛素化促使了 SLR解[58-59]。gid2(gibberellin insensitive dwarf2)也是水稻 GA 不灵敏变异体，GID2 调控 SCF E体的一个 F-box 亚基的生成，它和 OsSkp15 结合变成 SCF 多聚体的一个元件；SLR

图 1-3 油菜素内酯的生物生成代谢途径（注：引自 Shozo Fujioka 等[68]）中与 BR 合成相关的株高基因，见附录 A 表 A-3。水稻 BR 缺失型变异体发现，给它们施加油菜素内酯后恢复正常。 d2 是 BR 缺失型变异体，D2 调控 BR 代谢过程中的另一个主效酶（CYP90素 P450 家族 CYP90D 类[14]。 brd1 是 BR 缺失型变异体，株高矮小、叶鞘和叶片变小，且叶呈现卷曲；B C-6 氧化酶(OsBR6ox)的生成，是一类细胞色素 P450 蛋白，在油菜素内酯作用[24]。 brd2 的茎秆略低，属于中矮秆；与拟南芥的 DIM/DWF1 基因功能相近，素内酯代谢前期的 24-亚甲基胆固醇(24-MC)到菜油甾醇(CR)的过程，变异类 BR 效应物 DS(dolichosterone)，可能在水稻中是 BR 代谢的补充过程[25 d11 株高降低和粒长变小，D11 调控细胞色素 P450(CYP724B1)的生成，
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本文编号：2868021