Virgibacillus halodenitrificans PDB-F2甘氨酸甜菜碱转运基因的克隆与渗透胁迫响应

发布时间：2020-11-05 09:12

　　 Virgibacillus halodenitrificans PDB-F2是一株在高盐条件下有效降解苯酚的革兰氏阳性中度嗜盐菌,可应用于高盐有机废水的处理。中度嗜盐菌主要通过自身合成或转运相容性溶质来实现耐盐,对于PDB-F2转运相容性溶质的耐盐机制的研究还很少。本文主要对PDB-F2转运甘氨酸甜菜碱的耐盐机制进行了研究,丰富了中度嗜盐菌V.halodenitrificanPDB-F2耐盐机制的理论研究,对于PDB-F2应用于高盐有机废水的处理以及利用合成生物学加强普通降解菌的耐盐性能具有重要意义。本文首先通过核磁共振(NMR)确定了V.halodenitrificans PDB-F2在高盐条件下对甘氨酸甜菜碱的转运,与自身合成四氢嘧啶相比,PDB-F2会优先转运外界的甘氨酸甜菜碱以抵抗渗透胁迫,外源添加的甜菜碱会抑制PDB-F2胞内四氢嘧啶的合成。外源甘氨酸甜菜碱对PDB-F2的渗透保护作用的研究结果表明,甜菜碱显著提升了 PDB-F2在6%-15%NaCl盐度下的耐盐生长性能与耐受盐度,其最大耐受盐度达15%NaCl。利用E.col MKH13因相容性溶质合成基因与转运基因存在缺陷而不能于4%NaCl盐度下生长的特点,对V.halodenitrificans PDB-F2全基因组预测的转运基因betL,opuD1,opuD2和opuD3进行了功能验证,证明了它们是编码甜菜碱转运蛋白的基因。而且通过E.coli MKH13测定了 BetL、OpuD1、OpuD2和OpuD3对甜菜碱的亲和性,其亲和力大小依次为BetLOpuD1OpuD3OpuD2。利用实时荧光定量PCR对V.halodenitrificans PDB-F2转运基因betL,opuD1,opuD2和opuD3转录水平的研究表明,转运基因的转录水平与胞内甜菜碱的含量随着盐度的增加而增加,betL、opuD1和opuD3的最大值均在12%NaCl盐度下,说明转运基因的转录水平和甜菜碱的转运量取决于外部施加的渗透胁迫的程度。转运基因由NaCl诱导表达,而甜菜碱对于基因转录表达虽然没有诱导作用,但是影响转运基因的转录水平,其最大的转录水平发生于NaCl与甜菜碱共同存在的条件下,且转运基因对甘氨酸甜菜碱具有转录特异性;外界渗透胁迫引起的V.halodenitrificans PDB-F2甜菜碱转运,不仅依赖于渗透刺激引起的的转运基因转录,而且与被刺激的转运蛋白活性水平有关。
【学位单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：X172;X703
【部分图文】：

性溶质”这种策略为适应渗透变化的环境提供了一种非常通用的手段，正如许多微生物??完全依赖有机相容性溶质进行渗透压反应一样［２８］。在有限的范围内，有机相容性溶质的??积累是微生物世界的普遍反应。图１．２［２９］是５ａｄ／／ｗ如加７＾的耐盐机制示意图，显示的??是介导细胞Ｋ＋和Ｎａ＋稳态，合成渗透压保护剂Ｌ－脯氨酸，转运相容性溶质（Ｏｐｕ转运??蛋白）和在低渗冲击下用作快速释放离子和有机物的安全阀ＭｓｃＳ－与ＭｓｃＬｔｙｐｅ机械敏??感通道的系统。??Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ?ｓｏｌｕｔｅ??ｕｐｔａｋｅ??Ｉ?Ｏｐｕ?ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ??１．９?ＭＰａ?Ｉ＂Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ＊］?｜??ｓｏｌｕｔｅ?？？？：纖??Ｎａ．＾＊ＮａｔＡＢ?‘一．二；＇＇．．??Ｐｒｏｌｉｎｅ??＿ＡＮｈａＣ?ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ＭｓｃＳ?Ｓ??ＩＮｈａＫ?［Ｋ１?，薄?ｗ??Ｎａ．＂＾￣?Ｋ．?Ｋ．??ｊＮｈａＫ?Ｊ＾ＫｈｔＴＵ?｜?ＹｕｇＯ?｜?ＫｔｒＡ／Ｂ?｜?ＫｔｒＣ／Ｄ??Ｋ＊?Ｋ＊?Ｋ＊??图１．２价／ｃ／Ｚ／ｗＳｉ＾ｗＭ／Ｚｓ的耐盐机制??Ｆｉｇ．?１．２?Ｓａｌｔ－ｔｏｌｅｒａｎｃｅ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?Ｂａｃｉｌｌｕｓ?Ｓｕｂｔｉｌｉｓ??１．３相容性溶质耐盐机制概述??１．３．１相容性溶质种类和作用机制??相容性溶质是指极易溶、不带电荷的小分子量有机物质

热力学效应、疏水作用增加等也使相容性溶质对生物大分子产生稳定作用，防止其延展??变性［３５］。所以细胞液中相容性溶质的这种不均匀分布产生热力学驱动，促进蛋白质的正??确构象和蛋白质组装体的形成，从而保持其生物学功能［３６］。图１．３是蛋白质和相容性溶??质之间相互作用的示意图。??Ａ?６?＾??、，：ｖ，／?ｎ??图１．３相容性溶质作用机制示意图??（注：Ａ蛋白质的结构状态：Ｂ存在相容性溶质时蛋白质的结构状态）??Ｆｉｇ．?１．３?Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ?ｓｏｌｕｔｅ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ａｃｔｉｏｎ??（Ｎｏｔｅ：?Ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｐｒｏｔｅｉｎ；?Ｂ?Ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｗｉｔｈ?ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ?ｓｏｌｕｔｅ）??１．３．２相容性溶质耐盐机理??在较高的盐度下，中度嗜盐菌需要通过自身合成或转运相容性溶质来抵御高盐环境??带来的不利影响。微生物细胞通过感知外界渗透胁迫的程度，可以微调相容性溶质在细??胞内积聚的水平。相容性溶质的类型是多样性的，下面对一些普遍的相容性溶质进行介??绍。??（１）

?华东理工大学硕士学位论文??定的相容性溶质四氧喃唳（Ｅｃｔｏｉｎｅ?）及其衍生物轻基四氢喃晻（Ｈｙｄｒｏｘｙｅｃｔｏｉｎｅ?）（图１．４?）??是Ｎ－乙酰化氨基酸的环状氨基酸衍生物［３７］。在嗜盐菌中，四氢嘧啶主要在高的盐度下??与脯氨酸一起产生，但在细胞周期的晚期稳定期，四氢嘧啶与脯氨酸的比率大大增加［３８］。??编码四氢嘧啶生物合成途径酶的基因形成以盐度依赖性方式表达的操纵子，在??３ＭＮａＣｌ浓度时最大表达。??（３）
【参考文献】

相关期刊论文 前4条

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本文编号：2871426