葡萄VvmybAl基因表达分析和功能验证

发布时间：2020-11-07 14:04

　　 葡萄果皮色泽是果实重要的外观品质之一,也是决定葡萄酒质量的关键因素,而果皮颜色主要是由花色苷含量及组成成分决定。花色苷的生物合成主要受结构基因和调节基因的控制。本文采用酵母双杂交(yeast two-hybrid system)、酵母单杂交(yeast one-hybrid system)和病毒诱导基因沉默(virus induced gene silencing)等技术,对葡萄转录因子mybA1与花色苷生物合成结构基因UFGT、DFR作用机制及mybA1转录因子沉默后花色苷含量、花色苷合成通路中关键酶的表达量进行分析,以期阐明转录因子myb41在花色苷合成通路中调控机制。主要研究结果如下:1、葡萄果实VIGS体系建立以'红地球'转色期葡萄果实为试材,将VvmybA1编码区422-753反向插入pTRV2载体上,分别将pTRV2-mybA1和pTRV1转入农杆菌GV3101感受态细胞中,以OD600=0.5、1、1.5、3的菌液浓度,在真空条件下侵染葡萄果实,然后于26℃,16h光照,8h黑暗的条件下培养。15d后,发现OD600=1的菌液浓度效果最好。2、转录因子myb41功能分析采用OD600=1的菌液浓度侵染'极早蜜',培养10d,处理组几乎均保持绿色,而对照组则呈红色,继续培养5d后,处理组依然保持绿色。花色苷测定结果表明:对照组中'红地球'和'极早蜜'中花色苷含量分别是处理组的1.36、5.00倍,且在'极早蜜'中为显著性差异(P0.05)。RT-PCR分析结果表明,处理组mybA1表达量极低;qPCR分析结果显示:mybA41、mybA2、DFR、UFGT在'红地球'中基因表达量下降分别为:73%、47%、80%、8%(对照表达量以 100%计算).,mybA1、mybA2、DFR、UFGT、LAR1、LAR2、ANR、ANS在'极早蜜'中基因表达量下降分别为:97%、95%、72%、42%、45%、53%、73%、99%(对照表达量以100%计算)。差异显著性分析表明:在'红地球'中mybA1、DFR与对照相比为极显著差异(P0.01),mybA2为显著差异(P0.05);在'极早蜜'中,mybA1、mybA2、DFR、ANS与对照相比为极显著差异(P0.01),UFGT、LAR1、LAR2、ANR显著差异(P0.05)。3、蛋白互作分析根据V mvmybA1、VvUFGT、VvDFR CDS 序列和 pGBKT7、pGADT7 多克隆酶切位点,构建重组质粒 pGBKT7-mybA1、pGBKT7-DFR、pGBKT7-UFGT、pGADT7-mybA1。转录激活功能分析及毒性检测结果表明,Vvmyb41编码的蛋白具有转录激活功能,VvUFGT、VvDFR编码的蛋白不具有转录激活功能且无毒无害。酵母双杂交结果表明,在酵母水平中mybA1蛋白与UFGT、DFR蛋白均不互作。4、DNA-蛋白质作用分析从葡萄基因组数据库中获得UFGT、DFR启动子序列,用PLANTCARE预测启动子上的作用元件,获得与MYB结合的MBS顺式作用元件,将MBS顺式作用元件串联获得诱饵元件序列,MBS顺式作用元件突变为阴性对照,将pGADT7-mybA1分别与pMBS(UFGT)-AbAi、pMBS(DFR)-AbAi共转化的酵母菌Y1Hgold细胞(试验组)、pGADT7-mybA1 分别与 p[Mutant(UFGT)]-AbAi、p[Mutant(DFR)]-AbAi 共转化的Y1Hgold酵母菌(阴性对照)和p53-AbAi与pGAD-Rec-p53共转化的酵母菌(阳性对照)分别涂于SD/-Ura/-Leu/100 mM Aba固体平板上,结果显示,试验组与阳性对照均能在固体平板上生长,而阴性对照不能生长,证明VvmybA1编码的蛋白能够识别VvUFGT、VvDFR基因启动子。
【学位单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S663.1
【部分图文】：

图３ＶＩＧＳ作用机制＿??Ｆｉｇ．３?Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ?ｇｅｎｅ?ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ网??Ｓ?应用??学的发展，对未知植物基因功能的研究成了研究热点，而基因组测的提供大量信息，因此就需要快速高效的基因功能鉴定方法。转基的鉴定基因功能的一种方法，但因操作复杂、转化效率低、周期长的木本植物较为难实施；而ＶＩＧＳ技术能够弥补转基因技术的不足，短、沉默效率高、经济实惠，且整个过程并不需要通过组织培养再转基因植株，从而大大节省了物种基因功能分析所需的时间优点，其已成为一种广泛、高效的方法被用来进行功能分析。??反应??

如果在酵母水ｆ？中，诱饵蛋白和靶蛋白相互作用，则转朵因子的结合域和激??活域被拉近，当足够靠近，报告基因被起始转糸；反之，报告基因将不表达１？。因此，??报告椹Ｗ的表达４古被作为蛋白质凡作情况的检测标准。酵母双杂交原理示意图４丨７１１。??／?ＧＡＬ４Ａ０?＼??ＳＬｉｌｒａｒｙ?ｐｒｏｔｏｎ??????ｔｒａａｓｃｒｉｐｔｌｏＢ??－ｇａｌｕａｓ?二：ｎ〇ｔｏｒ￣??图４酵母双杂交原理［７１］??Ｆｉｇ．?４?ｔｈｅ?ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ?ｏｆ?ｙｅａｓｔ?ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ?ｓｙｓｔｅｍ＊７１１??１．３．２酵母双杂交应用??（１）在蛋白质组学方面的应用??１１??

基因的表达，筛选出与已知顺式元件结合的转录因子［９５］。即相比较于酵母双杂交，在酵??母单杂交体系中，省略了?ＢＤ－Ｘ蛋白质杂交体，而用特异的ＤＮＡ序列取代ＤＮＡＧａｌ４ｐ??结合位点［％１。酵母单杂交原理如图５［９８】。??／ｃＤＮＡ＞．??库筛??酵聊＾＼??，基ＩＩ编码产物＼??（??（＾转录因０?达）??顒式元件顺元件式＾?Ｐｍｉｎ?ＥＥＳ？Ｕ／??图５酵母单杂交原理??Ｆｉｇ．?５?ｔｈｅ?ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ?ｏｆ?ｙｅａｓｔ?ｏｎｅ－ｈｙｂｒｉｄ?ｓｙｓｔｅｍ＾??１．４．２酵母单杂交应用??（１）
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本文编号：2874044