下调Perilipin 1基因表达对3T3-L1细胞脂解的影响

发布时间：2020-11-07 07:26

　　 目的:研究下调围脂滴蛋白基因(PLIN1)表达对3T3-L1细胞脂解的影响。方法:采用RNA干扰技术,构建3组阳性及1组阴性sh-PLIN1重组载体,并进行菌液PCR和DNA测序鉴定。Western blot测定PLIN1A蛋白表达,评价载体下调效果。细胞转染有效载体2天后,Bodipy 493/503染色脂滴;酶学方法测定细胞中甘油三酯和甘油含量;Western blot检测甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)及其磷酸化蛋白(p-HSL)的表达。酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞中环磷酸腺苷(c AMP)和蛋白激酶A(PKA)的浓度。结果:各sh-PLIN1干扰载体构建成功,且3组阳性载体均能显著下调PLIN1A蛋白的表达(P0.05)。转染有效载体后,与阴性转染组相比,sh-PLIN1转染组细胞中脂滴减小,甘油三酯含量降低,甘油含量升高,ATGL和HSL相对表达量显著升高(P0.05),p-HSL相对表达量及c AMP、PKA的浓度无显著性差异(P0.05)。结论:下调PLIN1基因表达可加快3T3-L1细胞脂解速率,其可能通过上调ATGL和HSL的表达而实现,c AMP/PKA信号通路对其无明显调节作用。
【部分图文】：

2016，36(3)赵志武等:下调Perilipin1基因表达对3T3-L1细胞脂解的影响量分光光度计测定，其A260/A280值均介于1．8左右，符合纯度要求;4组的质粒浓度分别为(171．7±9．5)ng/μl、(184．2±9．5)ng/μl、(138．0±8．2)ng/μl和(241．1±10．7)ng/μl。质粒琼脂糖凝胶电泳检测发现，4组目的条带均约为6400bp，与预测结果一致，说明质粒提取准确(图1)。另外，DNA测序鉴定结果与4组设计的序列完全一致，进一步证实各sh-PLIN1重组载体构建成功。图1sh-PLIN1重组载体鉴定Fig．1Identificationofsh-PLIN1vector(a)BacteriumliquidPCＲreactionofsh-PLIN1recombinantvectors1:sh-PLIN1-1group;2:sh-PLIN1-2group;3:sh-PLIN1-3group;4:sh-PLIN1-4group(negativecontrolgroup);5:ddH2Ogroup;6:Emptyvectorgroup;M:DNAmaker(b)Gelelectrophoresisofeveryrecombinantplasmid1:sh-PLIN1-1group;2:sh-PLIN1-2group;3:sh-PLIN1-3group;4:sh-PLIN1-4group2．2转染效率及PLIN1A蛋白表达细胞经诱导分化6天和转染2天处理后，sh-PLIN1-1组、sh-PLIN1-2组、sh-PLIN1-3组和sh-PLIN1-4组细胞转染率分别为(47．2±5．4)%、(43．6±6．3)%、(44．2±5．0)%和(48．5±7．1)%，均适用于PLIN1下调效果测定。经Westernblot检测，与sh-PLIN1-4组相比，sh-PLIN1-1组、sh-PLIN1-2组和sh-PLIN1-3组PLIN1A蛋白表达量显著下降(P＜0．05)，而未转染组无明显差异(P＞0．05)，表明3组阳性sh-PLIN1重组载体均可有效下调PLIN1A蛋白的表达(图2)。随后用sh-PLIN1-1阳性载体作为sh-PLIN1转染组，sh-PLIN1-4阴性载体作为阴性转染组进行后续实验研究。2．3sh-PLIN1载体对脂滴形态的影响经Bodipy493/503和Hoechst33258染色后，3组细胞中脂滴(绿色荧光)均围绕细

A蛋白表达量显著下降(P＜0．05)，而未转染组无明显差异(P＞0．05)，表明3组阳性sh-PLIN1重组载体均可有效下调PLIN1A蛋白的表达(图2)。随后用sh-PLIN1-1阳性载体作为sh-PLIN1转染组，sh-PLIN1-4阴性载体作为阴性转染组进行后续实验研究。2．3sh-PLIN1载体对脂滴形态的影响经Bodipy493/503和Hoechst33258染色后，3组细胞中脂滴(绿色荧光)均围绕细胞核(蓝色荧光)分布，出现典型的“花环型”结构。与阴性转染组相比，sh-PLIN1转染组中直径大于2μm的脂滴所占比例下降50．1%，而小于1μm的脂滴所占比例增加1．69倍，说图23T3-L1细胞中PLIN1A蛋白表达Fig．2ExpressionofPLIN1Aproteinin3T3-L1adipocytes(a)WesternblotassayofPLIN1Aexpression(b)ＲelativelevelofPLIN1A(a)，(b)TheproteinlevelofPLIN1A1:sh-PLIN1-1group;2:sh-PLIN1-2group;3:sh-PLIN1-3group;4:sh-PLIN1-4group(negativecontrolgroup);5:Notransfectiongroup;a:P＜0．05明sh-PLIN1转染组中脂滴减校另外，阴性转染组与未转染组中脂滴形态无明显差异(图3、图4)。图3脂滴荧光染色Fig．3Fluorescencestainingoflipiddroplets(rule=25μm)2．4sh-PLIN1载体对细胞内甘油三酯和甘油含量的影响与阴性转染组比较，sh-PLIN1转染组细胞内甘油三酯含量下降，甘油含量升高，两者差异均有统计学意义19

跣宰?咀橄啾龋?sh-PLIN1转染组中直径大于2μm的脂滴所占比例下降50．1%，而小于1μm的脂滴所占比例增加1．69倍，说图23T3-L1细胞中PLIN1A蛋白表达Fig．2ExpressionofPLIN1Aproteinin3T3-L1adipocytes(a)WesternblotassayofPLIN1Aexpression(b)ＲelativelevelofPLIN1A(a)，(b)TheproteinlevelofPLIN1A1:sh-PLIN1-1group;2:sh-PLIN1-2group;3:sh-PLIN1-3group;4:sh-PLIN1-4group(negativecontrolgroup);5:Notransfectiongroup;a:P＜0．05明sh-PLIN1转染组中脂滴减校另外，阴性转染组与未转染组中脂滴形态无明显差异(图3、图4)。图3脂滴荧光染色Fig．3Fluorescencestainingoflipiddroplets(rule=25μm)2．4sh-PLIN1载体对细胞内甘油三酯和甘油含量的影响与阴性转染组比较，sh-PLIN1转染组细胞内甘油三酯含量下降，甘油含量升高，两者差异均有统计学意义19
【共引文献】

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本文编号：2873629