黑毛雪兔子表皮毛发育相关基因ShTTG1的克隆及功能研究

发布时间：2020-11-07 18:00

　　 黑毛雪兔子(Saussurea hypsipeta Diels),属菊科(Compositae)风毛菊属(Saussurea DC.),是一种生长于青藏高原地区的珍稀、濒危药用植物。同时,它又是一种典型的高山植物。植株密被表皮毛是黑毛雪兔子最具有代表性的形态特征,并且是黑毛雪兔子对极端环境适应的一种特殊结构。研究黑毛雪兔子表皮毛的形成和发育过程,对揭示高山植物适应环境的特殊机制将具有重要的理论意义。为此,本研究以黑毛雪兔子作为实验材料,在建立起黑毛雪兔子离体再生体系的基础上,通过RT-PCR,结合RACE技术,克隆了与表皮毛发育相关的基因TTG1,并研究了该基因的功能。主要研究结果如下:1.以野生苗叶片为外植体,通过愈伤组织途径建立了植株再生体系。以MS为基本培养基,附加2.0 mg·L~(-1) 2,4-D和0.5 mg·L~-11 6-BA,适于愈伤组织的诱导;愈伤组织在含有0.5 mg·L~(-1) 2,4-D的MS培养基上继代后,在附加1.0 mg·L~(-1) 6-BA和0.2 mg·L~(-1) NAA的MS培养基上,愈伤组织分化率为84.45%;在附加0.2mg·L~(-1) IAA和0.2%活性炭的1/2 MS培养基上,再生芽的生根率为82.2%;再生植株移栽到盆土中,大约有16.7%的苗存活,并能够正常的生长。以再生苗叶片为外植体,通过不定芽的直接诱导建立了植株再生体系。以MS为基本培养基,附加0.5 mg·L~(-1) 6-BA和0.5 mg·L~(-1) NAA,适于叶片不定芽的直接诱导,平均每个外植体产生4.7个不定芽。2.克隆得到黑毛雪兔子TTG1基因。TTG1基因cDNA全长1378 bp,包含1014 bp的开放阅读框,118 bp的5’端非编码区,225 bp的3’端非编码区和21bp的ploy(A)尾巴。该基因共编码337个氨基酸残基,分子量为37.47 kDa,等电点4.82。同源比对显示,推导出来的氨基酸序列与同一属植物水母雪莲(Saussurea medusa)的同源性为95.25%,与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)、黄瓜(Cucumis sativus)的同源性分别为73.91%、73.33%和74.78%。黑毛雪兔子TTG1基因的氨基酸序列有5个WD40 repeat,说明该基因可能编码一种WD40蛋白,将该基因命名为ShTTG1(MF805763)。同时,克隆得到黑毛雪兔子ShTTG1基因的一对等位基因,命名为ShTTG1a(MG564780)和ShTTG1b(MG564781),基因长度均为1328 bp,CDS区为1014bp,编码337个氨基酸;等位基因之间有3个核苷酸差异位点,在CDS区有1个差异位点,导致所编码的多肽序列在250位点上的氨基酸存在差异,ShTTG1a为亮氨酸,ShTTG1b为甲硫氨酸。3.采用qRT-PCR技术,检测黑毛雪兔子5个内参基因(Actin、18S rRNA、GAPDH、EF1α和TUA)在不同组织中,以及低温胁迫(4℃)和紫外胁迫处理下叶组织中的表达情况。在Delta Ct、geNorm、Best Keeper和Norm Finder软件分析的基础上,利用Ref Finder在线工具综合分析5个内参基因的稳定性。结果表明,在不同组织中表达最稳定的是GAPDH;在低温胁迫下表达最稳定的是18S rRNA;在紫外胁迫下表达最稳定的是Actin。为黑毛雪兔子相关基因的表达研究提供了较稳定的内参基因。以GAPDH作为内参基因,检测ShTTG1基因在黑毛雪兔子根、茎、叶和花中的表达情况。结果表明,ShTTG1基因在4种组织中都有表达,其中在叶中的表达量最高。将ShTTG1基因连接到pColdⅠDNA表达载体,构建了原核表达载体pColdⅠDNA::ShTTG1,并导入到BL21(DE3)大肠杆菌中进行原核表达,表达产物用SDS-PAGE电泳分析。结果表明,目的蛋白在大肠杆菌中表达,表达蛋白的分子量接近40 kDa,与预测的融合蛋白分子量大小相符。4.构建了ShTTG1基因的超表达载体35S::ShTTG1,在根癌农杆菌介导下,将目的基因ShTTG1转入本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中。通过PCR和RT-PCR检测,获得3株转基因烟草植株。形态学比较表明,转基因植株叶柄和叶片上的表皮毛较长,且在表皮毛密度上与对照有显著差异。构建了ShTTG1基因的亚细胞定位载体35S::ShTTG1-GFP。共聚焦结果显示,ShTTG1蛋白定位于细胞核中,这符合转录因子的特征。将35S::ShTTG1-GFP载体转化本氏烟草。在转基因烟草叶片中,除了叶脉外,表皮毛中也有较强的荧光信号,推测ShTTG1基因与表皮毛发育有关。对黑毛雪兔子进行了紫外和低温胁迫处理。结果表明,在紫外处理下,ShTTG1基因的表达量在3 h后显著提高,之后下降。而在低温处理下,ShTTG1基因的表达量与对照组差异不显著,推测黑毛雪兔子的表皮毛可能是针对紫外辐射的一种适应结构。
【学位单位】：青海大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S567.239
【部分图文】：

、细胞分化、细胞周期调控等过程[17]。由于拟南芥表皮毛结构特殊，属，并广泛分布于花瓣、茎、茎生叶和莲座叶上，有利于细胞生命周期，发生，起源和发育的研究。（1）拟南芥表皮毛的形态发育拟南芥表皮毛在发育初期有丝分裂活动停止，特定的表皮毛细胞开始膨变大，细胞核开始复制（图 1.1A1）；经过 3 次核内复制，其 DNA 含量长[18]；随着植物表皮毛的发育，表皮毛主干结构逐渐形成，原表皮细胞膨向外延伸（图 1.1 A2）；垂直凸起的顶端细胞，围绕凸起顶点开始形成支（图 1.1 A3）；表皮毛顶端形成凸起后，细胞整体增大，细胞核进行，细胞接着进行弥散性生长，大多数表皮细胞最终形成 3 个分支（图 1.1A；伸长阶段钝状的表皮形成分支，并沿着整个细胞轴线延伸，随着分支的逐渐变尖（图 1.1B5）[20]；表皮细胞形成完整的表皮毛后，在表皮毛表数量不等的玻璃状乳突，并有起支撑作用的表皮细胞围绕在成熟表皮毛部（图 1.1 B6）[21]。

毛的发生[44]。GL1 和 TTG1 的等位基因之间的互作，不但能够产生发育不完全的表皮毛簇，还会出现非特异性表皮毛簇的增加[45]。这些都说明，TTG1 和 GL1 都能限制表皮毛的启动，并且 TTG1 和 GL1 作为复合体共同发挥作用。综上所述，TTG1 和 GL1 基因在表皮毛发育调控中进行平衡调节，控制表皮毛启动与限制表皮毛发生。TRY 蛋白能够与 GL1 和 TTG1 互作，来改变 GL1 和 TTG1 复合体的活性，并影响表皮毛发育启动活性。研究发现，TRY 主要介导早期表皮毛周边细胞的侧向抑制，在 TRY 突变体中，约 5%～10%的表皮毛成簇存在，现已有实验证明 TRY 主要功能是侧向抑制[46]。在 CPC 转录因子研究中发现，CPC 转录因子功能与 TRY 相同，在过表达试验中 CPC 基因抑制了拟南芥表皮毛的发生，推测 CPC 基因属于负调节基因[47]。在互作实验中发现，GL2 能够调控根毛表皮细胞的发育，在此过程中受 MYB-bHLH-TTG1 复合体的影响。（3）拟南芥表皮毛分化的调控模型目前，在拟南芥中有两种表皮毛发育模型在共同发挥作用，即激活抑制模型（Activator-Inhibitor Model）和激活消耗模型（Activator-Depletion Model）。

（图 1.2）[48]。近几年的相关研究阐明，GL1 和 TTG1 都能够与 bHLH 转录因子类基因 GL3、EGL3 相互作用，并形成 MYB-bHLH-WD40 蛋白复合物，正向调控表皮毛起始；随着表皮毛起始复合物 MYB-bHLH-WD40 的积累，达到一定量时，就能够激活 GL2 的表达，促进表皮毛形成。由于 GL2 属于含有 HD-Zip 结构的转录因子，作为表皮毛的正向调控因子，在表皮毛形成中发挥重要的作用[48][50]。
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本文编号：2874293