农杆菌介导的人血清白蛋白基因在小立碗藓中的转化及表达研究

发布时间：2020-11-08 16:26

　　 人血清白蛋白(HSA)是人血浆中的蛋白质,其非糖基化的单链多肽包含585个氨基酸,分子量为66kD。在临床上HSA可用于治疗休克与烧伤,用于补充因手术、意外事故或大出血所致的血液丢失,也可以作为血浆增容剂。在临床和生物技术中具有重要作用,存在巨大的市场需求,单纯靠人血液提取HSA是难以满足市场需求的。而且人血来源容易导致各种污染以及疾病的传播。为摆脱血浆来源有限的产能限制以及解决利用血浆来源的市售HSA存在传染病毒等的风险,利用植物生产抗体等药用蛋白或治疗性蛋白是植物生物反应器的一个重要应用领域。小立碗藓(Physcomitrella patens)在生物技术中用作重组治疗性蛋白质和具有商业价值的天然产物的异源表达宿主具有很大的优势。因其生活史周期短,易于培养,转基因植株易于分析。而且,小立碗藓是陆生植物中基因重组率最高的植物,有“绿色酵母”之称。其核基因组易于与有同源片段的外源DNA发生高频率的同源重组,小立碗藓以单倍体的形式克隆生长使得其遗传变异水平相对较低。这些优势有利于遗传转化及基因操作后的筛选。小立碗藓全基因组测序已完成,这使得其生物信息学研究及功能基因组对比可以进行。所以选取小立碗藓作为生物反应器生产重组HSA(rHSA)。利用根癌农杆菌介导法将外源基因转入小立碗藓的实例在国内外还没有被报道。具体研究内容和结果如下:1、将pYB1906载体进行改造,利用PTDS基因合成方法人工合成了rHSA基因并连接入pYB1906载体构建了新的植物载体pYB2924,该载体在HSA基因的5’端引入了小立碗藓MTH1蛋白分泌信号肽序列,便于实现在小立碗藓中的分泌表达。2、利用农杆菌介导小立碗藓转化体系,通过农杆菌侵染原生质体的方法将pYB2924基因导入小立碗藓中,得到了具有潮霉素(HYG)抗性的阳性小立碗藓转化植株。并且成功培养出能够分泌rHSA的稳定转化株,建立了成熟的农杆菌介导体系。3、将筛选出的阳性转基因植株经过PCR扩增以及RT-PCR检测证实pYB2924基因已整合入小立碗藓的基因组并在转录水平得到了表达,利用SDS-PAGE蛋白电泳证实了该蛋白的表达,最后用ELISA检测证明在小立碗藓中分泌出了rHSA,根据ELISA测定结果,其表达量为27mg/L。
【学位单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q943.2
【部分图文】：

4、将电击杯中的混合液混匀转移至 1.5mL 离心管中摇床培养 1h。5、吸取 80μL 涂抗性板筛选转化子，28℃培养。6、10%甘油保存。2.4 结果分析2.4.1 rHSA 基因的序列测定序列测定由上海生工公司代为测定（见附录）。2.4.2 植物表达载体的构建将上述测序正确的质粒经过 BamHI 和 SacI 酶切连接入经过同样酶切的植物载体 pYB1906 中。对形成的重组载体 pYB2924 进行酶切鉴定。预计片段长度为1848bp 和 5824bp，结果如下图，与预期结果一致。

图 2-3 PTDS 法合成的 rHSA 基因检测体（pYB2924）具有以下特点:，是在 pCamBIA-1301 载体的基基因，CaMV35S 启动子控制 Ori 位点，可以在大肠杆菌中进接合转移有关。选标记基因。该载体还带有广宿ta，可以在其它 G-细菌中进行复’ 端 引 入 了 编 码 小 立 碗 藓rolase1 (PpXTH1 [EMBLAJ8432中的分泌表达，终止子选择根癌1 的 5’端用来控制 HSA 基因的

-4 pYB2924 的转化鉴定 a. pYB2924 电击转化论于人血来源的 HSA 的量有限，而市场对足市场的需求，而利用同源重组率很高程度上为植物生产 HSA 可以应用于生物化学合成全基因序列技术已经较为成熟方面的探索研究，甚至凭借基因工程技 PCR、DNA 改组（DNA shuffling）PCRp DNAsynthesis）法[79,80,81]等以上这些方合成。除以上方法以外还可利用 DNA 合段一般不超过 90bp[82]。本实验是通过 P因，并且在 HSA 基因的 5’端引入蛋白
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本文编号：2875031