黑曲霉磷脂酶D基因的克隆表达与生化特征解析

发布时间：2020-11-10 08:16

　　 磷脂酶D(Phospholipase D,简称PLD;EC 3.1.4.4)属磷脂酶超家族,主要作用于磷脂酰胆碱生成信号分子磷脂酸与胆碱。在医药行业,可以利用磷脂酶D的碱基交换反应对磷脂进行改性,以制备单一磷脂和稀有磷脂。随着应用的不断深入,对磷脂酶D的属性要求特别是生物活性与生化特征多样性的要求也越来越迫切。为此,本文通过对黑曲霉基因组中2个未知功能的磷脂酶D基因进行了克隆表达与生化特征解析,获得了如下主要结果:从黑曲霉基因组中筛查到2个疑似编码磷脂酶D的开放阅读框,pldA和pldB。二者的大小分别为2499 bp和3645 bp,分别编码832和1214个氨基酸残基;进一步通过氨基酸序列比对可知,PldA和PldB分别与来源于A.nidulans FGSC 26和A.kawachiiIFO 4308的磷脂酶D具有较高相似性,相似度分别为81.35%和95.60%,二者皆具有2个高度保守的HKD基序HxKxxxxDxxxxxxGS(G)和真菌磷脂酶D特有的基序YIENQFF,属于真菌磷脂酶D家族。提取黑曲霉CICIM F0510的总RNA,并反转录成cDNA,以此为模板,成功将pldA和pldB基因在毕赤酵母中进行了克隆表达,构建获得了 2株重组毕赤酵母菌GS-pldA和GS-pldB;摇瓶发酵水平上,重组磷脂酶PldA和PldB的酶活分别为0.59和0.43 U/mL;进一步通过硫酸铵沉淀、脱盐和凝胶过滤层析对它们进行纯化后,PldA和PldB的纯化倍数和得率分别为22.2倍和25.1%,47.9倍和31.7%。进一步分析其酶学性质,重组磷脂酶PldA的最适作用温度和最适作用pH分别是30℃和7.0,在30℃-50℃和pH 7.0-9.0下具有较好的稳定性;重组磷脂酶PldB的最适作用温度和最适作用pH分别为40℃和6.0,在30℃-40℃或pH 5.0-7.0下具有较好的稳定性;Ca2+、Mn2+、Ba2+和10%Tris对这两种磷脂酶D皆有显著的促进作用,乙腈则可使两个磷脂酶完全失活,而其他金属离子和化学试剂对二者均有不同程度的抑制作用;二者可在4℃下稳定保存30 d以上。两个磷脂酶均可水解底物卵磷脂生成磷脂酸。
【学位单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q78;Q55
【部分图文】：

革兰氏阳性菌；Ｇ＿，革兰氏阴性菌??１．１．３磷脂酶Ｄ的反应机理??磷脂酶Ｄ—般可以催化两种反应（图１－１）：其一，水解磷脂分子中的磷酸和有??机碱（如乙醇胺、胆碱等）羟基成酯键，生成磷脂酸（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ?ａｃｉｄ，ＰＡ）和有??机碱。ＰＬＤ水解反应的主要底物是磷脂酰胆碱（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＰＣ），在某些生物??体中ＰＬＤ也可以水解磷脂酰乙醇胺（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，?ＰＥ）［４４］和磷脂酰肌醇??（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ，ＰＩ）［４５］。其二，ＰＬＤ还可以催化各种羟基化合物与磷脂碱基结??合形成新的憐脂，这一重要特性称为ＰＬＤ的碱基交换反应（Ｂａｓｅ?ｅｘｃｈａｎｇｅ??ｒｅａｃｔｉｏｎ），也称转磷脂反应（Ｔｒａｎｓｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌａｔｉｏｎ）?［４６］。但也有报道称极少数??ＰＬＤ只有水解活性［４７，４８］。利用ＰＬＤ的碱基交换活性可以合成稀有磷脂和单一磷脂，??比如磷脂酰丝氨酸（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ

?—１８Ｓ??图３－３总ＲＮＡ的提取结果??Ｆｉｇ．?３－３?Ｔｈｅ?ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ??３．２．２磷脂酶Ｄ目的基因的扩增??以黑曲霉的总ＲＮＡ反转录生成的ｃＤＮＡ为模板，以表２－１两组引物进行目的基??因的扩增。使用０．８％的琼脂糖凝胶检测ＰＣＲ产物。电泳结果如图３－４所示，所扩增??的；？／以和；？Ｗ５的片段大小分别为２．５?ｋｂ和３．６?ｋｂ，与其预期大小（分别是２４９９和??３６４５?ｂｐ）相符。而且条带单一、清晰，表明基因克隆成功。??Ｍ?１?Ｍ?２??擊，制??國??图３－４目的基因ＰＣＲ产物电泳图??Ｆｉｇ．?３－４?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ??Ｍ：?ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ?１?ｋｂ?Ｐｌｕｓ?ＤＮＡ?Ｌａｄｄｅｒ；?１：鱗脂酶基因ｐ／以，？?２：鱗脂酶基因尸／必??３．３磷脂酶Ｄ重组菌的构建与表达??３．３．１重组质粒的构建??将ＰＣＲ获得的目的基因片段用ＡＴｗＩ进行酶切，经纯化回收后，用Ｔ４ＤＮＡ连接??酶将其与经过１和ＩＩ双酶切的质粒ｐＰＩＣ９Ｋ进行连接。重组质粒构建方式如??图３－５所示。??２９??

３．２．２磷脂酶Ｄ目的基因的扩增??以黑曲霉的总ＲＮＡ反转录生成的ｃＤＮＡ为模板，以表２－１两组引物进行目的基??因的扩增。使用０．８％的琼脂糖凝胶检测ＰＣＲ产物。电泳结果如图３－４所示，所扩增??的；？／以和；？Ｗ５的片段大小分别为２．５?ｋｂ和３．６?ｋｂ，与其预期大小（分别是２４９９和??３６４５?ｂｐ）相符。而且条带单一、清晰，表明基因克隆成功。??Ｍ?１?Ｍ?２??擊，制??國??图３－４目的基因ＰＣＲ产物电泳图??Ｆｉｇ．?３－４?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ??Ｍ：?ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ?１?ｋｂ?Ｐｌｕｓ?ＤＮＡ?Ｌａｄｄｅｒ；?１：鱗脂酶基因ｐ／以，？?２：鱗脂酶基因尸／必??３．３磷脂酶Ｄ重组菌的构建与表达??３．３．１重组质粒的构建??将ＰＣＲ获得的目的基因片段用ＡＴｗＩ进行酶切，经纯化回收后，用Ｔ４ＤＮＡ连接??酶将其与经过１和ＩＩ双酶切的质粒ｐＰＩＣ９Ｋ进行连接。重组质粒构建方式如??图３－５所示。??２９??
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本文编号：2877708