褶纹冠蚌谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆与表达分析

发布时间：2020-11-10 14:34

　　 褶纹冠蚌(Cristaria plicata)软体动物门,蚌科,我国常见育珠蚌之一,易被感染引发疾病,增加养殖行业风险,因而,进行贝类分子免疫方面的研究意义重大。本文运用巢氏PCR和RACE PCR克隆得到了褶纹冠蚌Mu型和Theta型谷胱甘肽硫转移酶基因的cDNA全长。CpGST3基因的cDNA全长为1026 bp,其中包含了558 bp的开放阅读框,编码185个氨基酸,5’端非编码区71 bp,3’端非编码区397 bp。预测蛋白分子量是21.7 kDa,等电点是5.38。CpGST4基因cDNA全长是1301 bp,其中包含了759 bp的开放阅读框,编码252个氨基酸,5’端非编码区185 bp;3’端非编码区357 bp。预测蛋白分子量为29.30 kDa,等电点为6.17。通过对CpGST3、CpGST4基因在蚌的五种组织中表达情况分析发现,CpGST3、CpGST4基因在鳃组织、肝胰腺、闭壳肌、外套膜、血淋巴中均有表达,CpGST3基因表达量最高的组织是肝胰腺,鳃中最低,CpGST4基因表达量最高的组织也是在肝胰腺中,但外套膜最低。并研究了微囊藻毒素刺激褶纹冠蚌后,CpGST3和CpGST4在血淋巴和肝胰腺中表达量的变化,结果显示:微囊藻毒素刺激蚌后,蚌血细胞和肝胰腺的CpGST3基因表达量开始上升,分别在24 h、12 h达到最高,随后逐步降低,CpGST4基因表达量也是逐步上升,表达量在12 h都达到了最高,随后逐步下降。将CpGST3、CpGST4基因的开放阅读框和PET-32a质粒经BamH1、HindIII双酶切之后,成功构建了PET-32a-CpGST3、PET-32a-CpGST4原核表达质粒。然后将重组质粒转入到BL21中,经IPTG,诱导8 h后,得到了融和蛋白,电泳检测显示重组蛋白均是以包涵体形式存在,用纯化柱进行纯化,分别得到浓度为0.4676 mg/mL的CpGST3融合蛋白和0.312 mg/mL的CpGST4融合蛋白。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

SMART技术原理图（引用自Clontech）

褶纹冠蚌总RNA提取图

第 2 章 褶纹冠蚌谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆与表达分析2.3.2 褶纹冠蚌 CpGST3、CpGST4 基因 cDNA 全长克隆经过 3’和 5’RACE 扩增，得到了 498 bp 和 523 bp 的序列。以 CpGST4 基因的中间片段为基础，通过 5’和 3’RACE 扩增分别得到 662 bp 序列和 579bp 序列（如图 2.4）。使用 DNAMAN 软件将中间片段、3’和 5’末端序列进行拼接，获得了 CpGST3、CpGST4 基因 cDNA 全长。
【参考文献】

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本文编号：2878045