茶树胞质型谷氨酰胺合成酶基因CsGS1s的克隆及其对不同氮源的响应

发布时间：2020-11-11 04:46

　　 茶树作为一种多年生叶用经济作物,充足的氮营养对其生长发育、生理生化代谢过程以及茶叶品质的形成起着至关重要的作用。然而,茶树对氮素的吸收利用能力有限,而且茶树偏爱铵态氮(NH_4~+-N),对不同氮源的利用效率存在差异,因此一般的茶园管理中,为保证经济效益,氮肥过量施用的情况较为普遍,但这必然会造成资源浪费和环境污染。谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS;EC6.3.1.2)是高等植物氮素同化过程中最为关键的催化酶之一,与植物氮素吸收、同化和利用效率(Nitrogen use efficiency,NUE)紧密相关,更重要的是,不同GS酶的基因成员在植物氮素吸收同化中功能不同。本研究以茶树栽培种龙井43为研究对象,克隆了参与氮同化的获得3个CsGS1基因的c DNA全长,对GS1s的表达产物的亚细胞定位和蛋白酶活性进行了研究,并研究了3个CsGS1基因在不同氮源中的表达模式和它们的组织特异性,以揭示其在茶树氮代谢中的具体功能作用。主要研究结果如下:1.克隆了3个茶树胞质型谷氨酰胺合成酶基因CsGS1.1、CsGS1.2和CsGS1.3,生物信息学分析CsGS1s编码的蛋白均具有GS家族的保守结构域—Gln-synt__C,为亲水性的位于细胞质中的非分泌型蛋白质,没有信号肽。通过Blast分析及进化树构建可知,茶树CsGS1.1与葡萄GS1.1的亲缘关系最近,茶树CsGS1.2、CsGS1.3与毛白杨GS1的亲缘关系最近;CsGS1.1s与拟南芥AtGln1;5、油菜BnGln1;5、大麦HvGS1;3、水稻OsGS1;3以及玉米ZmGS1;3表现出较近的亲缘关系。2.将克隆的3个CsGS1s基因各自的编码区分别与定位报告基因—绿色荧光蛋白GFP基因融合,对CsGS1s的表达产物进行精准的亚细胞定位。结果表明,CsGS1.1定位于细胞膜、质和核中,CsGS1.2定位于细胞膜、质中,CsGS1.3定位于细胞膜、质中。3.分别对3个CsGS1s编码区进行原核表达,纯化得到各对应的重组蛋白质。SDS-PAGE电泳结果蛋白CsGS1s分别约为42、42和58 kD。分析各重组蛋白质的谷氨酰胺合成酶催化特性显示,3个重组CsGS1s蛋白均能催化谷氨酸和氨反应,生成谷氨酰胺。4.茶树CsGS1s基因的表达存在时空特异性,即CsGS1.1/CsGS1.3基因在根部的相对表达量最高,CsGS1.2则主要在成熟叶中表达,但总体来看CsGS1.2在根茎叶中的相对表达丰度明显低于CsGS1.1/CsGS1.3。分别对NH_4~+-N、NO_3~--N两种培养条件下的3个CsGS1s的表达情况进行分析。在叶中,CsGS1.1的表达量在NO_3~-处理后期显著提高,而CsGS1.2/CsGS1.3主要对NH_4~+处理有响应;在茶树根中,CsGS1s的表达水平受NH_4~+-N的诱导显著高于NO_3~--N,尤其是CsGS1.1/CsGS1.2。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S571.1
【部分图文】：

矿质元素的变化。NH4+-N通过铵转运蛋白（Ammonium transporters，AMT）进入植物体内，被同化成有机态氮；而NO3--N则经硝转运蛋白（Nitrate transporter，NRT）的介导进入植物体经过硝酸还原酶（Nitrate reductase，NR）、亚硝酸还原酶（Nitrite reductase，NiR）还原为NH（伍炳华等，1994），才能进一步被同化成为植物自身可用的有机态氮（Maeda et al.，2014近年来随着研究的不断深入，研究者们发现参与氮素吸收和转运的不仅仅有AMT和NRT基因他一些基因也参与氮素的转运和吸收，从而共同完成氮吸收利用。Swarbreck等（2011）发现谷酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）在氮素吸收、转运和分配过程中起着重要作用。NH4+或NO3-通过根细胞膜上的转运蛋白吸收进入植株后，大部分NH4+在细胞基质中代谢分NO3-在细胞质中代谢而部分则经主动运输到达叶片。氮素被植物吸收后，氮素被同化成植物以利用的有机态氮。一般认为植物体内氮同化有2个途径，一个是NH4+-N与α-酮戊二酸在谷氨脱氢酶（Glutamate dehydrogenase，GDH）的作用下生成谷氨酸，另一个是NH4+-N经过谷氨酰合成酶（Glutamine synthetase，GS）/谷氨酸合成酶（Glutamate synthetase,GOGAT）循环途径成谷氨酰胺（莫良玉等，2001；李维等，2015）。但是GDH对NH3的亲和性较低，一般认为它要在解除氨毒中其主要作用（李常健等，2000），而GS/GOGAT途径才是植物中氮同化的主要径（图1.1），而且谷氨酰胺合成酶（GS）是氮同化的关键酶，是一种限速酶，起到氨库的作，也是将无机氮转化成有机氮的重要门户（Lea & Mifliu，1974）。

+才能参与GS/GOGAT循环过程（图1.2）。目前已报道的参与茶树氮素吸收利用的蛋白和主要基因详见表1.1。图 1.2 茶树氮素吸收利用过程简图Fig.1.2 Overview of nitrogen utilization and assimilation in tea plant

完整的未被降解的RNA是克隆基因全长的重要前提，本试验提取茶树‘龙井43’叶片的总RNA的OD值260/280基本在1.8-2.0之间，表明RNA纯度可以满足实验需要。经1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度，电泳结果如图2.1，结果显示RNA条带清晰，说明所获得的RNA完整性良好，可以进行后续试验。
【参考文献】

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本文编号：2878763