“二十世纪”梨果锈形成过程中木质素合成及调控基因的挖掘与表达分析

发布时间：2020-11-13 00:29

　　 梨(Pyrus)是世界主要水果之一,在世界各地广泛种植,在中国已有3000多年的栽培历史。果锈是影响梨果实外观品质的重要因素,是果实在发育过程中角质层龟裂、表皮细胞木栓化的结果。表皮细胞木栓化形成果点,木栓化程度越高果点突出表面形成锈斑。木栓化与木质素和酚类物质有关。木质素合成是一个复杂过程,涉及多个通路。本试验研究“二十世纪”梨果锈形成过程中木质素含量及相关酶活性、果皮角质变化情况,利用高通量测序技术对不同发育时期梨果皮进行转录组测序筛选与果锈形成相关基因和通路,进一步分析了相关基因在套袋及不套袋果皮间的差异,阐述梨果皮锈斑形成分子机理,其主要研究结果如下:1.确定苯丙氨酸解氨酶与过氧化物酶是梨果皮木质素合成关键酶。研究表明套袋与不套袋果皮中木质素含量在花后45 d最高,随着果实发育,木质素含量呈快速下降趋势,在花后75 d木质素含量趋于平缓。苯丙素代谢的关键酶——苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性变化与木质素含量的变化趋势高度一致,套袋与不套带梨果皮PAL活性在花后45 d最高,套袋果皮PAL活性在各时期均低于不套袋果皮;控制木质素单体合成的关键酶——过氧化物酶(POD)亦在花后45 d活性最高,且不套袋果皮中POD活性远高于套袋果。多酚氧化酶(PPO)是酚类物质合成关键酶,其活性在花后30 d最高,套袋果皮中PPO活性显著低于不套袋果。2.确定具有果锈的果实表皮拥有不同形态结构。利用光学显微镜发现花后30 d,套袋和不套袋果皮角质层较为平整,表皮层为1-2层,表皮细胞是长方形,细胞处于分裂期:在花后90 d,不套袋果实表皮角质层不平整,呈波浪起伏状,表皮层细胞间隙大。套袋果皮角质层较为平整,角质层较花后30 d增厚,表皮细胞排列紧密。利用扫描电镜发现花后30 d,套袋和不套袋果实表皮的角质膜差异不明显,角质膜平滑;花后90 d,未套袋果实表皮角质膜凹凸不平,果皮表面具有粗糙的扁层蜡膜结构,蜡层厚且难以观察到气孔,果皮表面大面积破损,果皮细胞间联结被完全破坏,形成空隙;而套袋果果皮表面果点较小,果皮表面蜡膜较为平整,空隙较小,角质膜厚度增加。3.获得与梨果锈形成相关的关键基因。通过Illumina HiSeq 2500对花后30d、45 d和花后90 d果皮进行转录组测序,测序获得三组样品clean reads分别为65,568,13、60,125,170和113,392,425,GC%在46,Q20在96%左右。经过差异基因筛选,得到花后30 d和花后45 d之间的差异基因2177个,花后30 d和花后90 d之间的差异基因有2543个;利用GO富集分析发现差异基因主要富集在生物过程中的次生细胞壁代谢类和木质素代谢类,细胞成分中的细胞和细胞部分类,分子功能中的结合和催化活性类;经过KEGG分析,共得到218个与果皮相关的代谢路径,筛选出23差异基因与苯丙氨酸代谢相关,94个差异基因与苯丙素生物合成相关。4.确定果锈形成过程中木质素合成调控关键基因。根据高通量测序结果,筛选42个与木质素合成相关、不同时期表达差异较大(FRKM2,Q value0.05)基因,用Real-time PCR,分析这些基因在套袋与不套袋果实表皮表达差异。结果表明,21个POD编码基因中,pbr030045.1、pbr000691.1、pbr022326.1、pbr002672.1 和pbr013214.1 这 5 个基因在不套袋果皮中的表达显著高于套袋果。这些基因的表达量与木质素含量成正相关。4个4CL编码基因中,pbr012851.1在不套袋果皮中是不表达的。Pbr013510.1是编码COMT的基因,pbr022402.1、pbr022405.1和pbr022403.1是编码CCR的基因,这4个基因在不套袋果皮中的表达量高于套袋果,与木质素含量成正相关。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S661.2
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
英文缩写及中英文对照表
一 文献综述
    1.1 梨果皮结构及果锈形成机理
        1.1.1 梨果实的组织结构
        1.1.2 梨果皮的角质膜
        1.1.3 梨果实的表皮层和亚表皮层
        1.1.4 果点的形成过程
        1.1.5 果锈的形成过程
    1.2 木质素及其生物合成的关键酶
    1.3 套袋技术
    1.4 转录组研究概述
    1.5 课题研究的技术路线
二 材料与方法
    2.1 试验材料
    2.2 试验方法
三 结果与分析
    3.1 果实表皮在不同发育阶段的症状
    3.2 木质素含量的变化
    3.3 果实发育过程中PAL、POD和PPO酶活性的变化
    3.4 “二十世纪”套袋和不套袋梨果皮组织结构观察
    3.5 梨果皮组织转录组测序
    3.6 转录组测序基因功能注释
    3.7 不同果实发育阶段果皮差异基因分析
    3.8 关键基因的挖掘
四 结论与讨论
    4.1 讨论
    4.2 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间科研情况

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本文编号：2881459