小麦eEF1B基因与中国小麦花叶病毒（CWMV）互作及其对病毒复制的影响
发布时间：2020-11-13 03:14
真核翻译延伸因子(eukaryotic translation elongation factor,eEFs)是一种重要的多功能调控蛋白。eEFs可以与多种病毒的蛋白、病毒RNA及基因组的非编码区(UTR)发生相互作用,从而有利于病毒完成生活史。eEF1B作为eEF家族的重要成员,其与病毒的互作研究还相对较少。本实验室在我国冬小麦上鉴定了一种由禾谷多黏菌(Polymyxagraminis)传播的新病毒—中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV),并在其分子生物学上取得了一些进展,但在其与宿主相互作用等领域研究尚少。因此,本研究首先克隆了小麦eEF1B的基因,并进行同源性分析和表达特性分析,然后基于CWMV侵染性克隆分析了CWMV与宿主eEF1B的互作关系,并取得了以下结果:首先,本研究通过RT-PCR扩增克隆了小麦的eEF1B,并命名为TaeEF1B。同源性分析发现TaeEF1B具有高度保守性,其保守结构域位于137-226 aa处。组织特异性表达分析表明TaeEF1B在小麦茎部具有较高的表达水平。另外,本研究也构建了TaeEF1B的原核表达载体并进行了诱导表达,获得TaeEF1B纯化蛋白,为研究其在CWMV侵染过程中的功能奠定基础。然后,利用CWMV的侵染性克隆在模式植物本氏烟(Nicotiana benthamiana,Nb)中分析了CWMV和NbeEF1B之间的关系。通过qPCR和Northern blotting实验发现,在本氏烟中NbeEF1B的基因沉默抑制CWMV CP和基因组RNAs的积累。反之,在本氏烟中NbeEF1B的瞬时过表达促进CWMV CP和基因组RNAs的积累,表明NbeEF1B正调控CWMV的复制。进一步通过酵母双杂交(Yeast two-hybrid,Y2H)、凝胶电泳迁移率实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)实验分析TaeEF1B与CWMV的互作方式。酵母双杂交实验未发现TaeEF1B与CWMV的RdRp之间存在相互作用;EMSA实验分析发现TaeEF1B能特异性地结合CWMV 3’UTR区,表明TaeEF1B可能通过与CWMV 3’UTR区的结合作用从而促进病毒复制。这些结果为进一步分析TaeEF1B促进CWMV复制的功能机制奠定基础。
【学位单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S432.41
【部分图文】：
1.2.2 CWMV 病毒基因组结构CWMV 病毒粒子呈杆状，直径约为 20nm、长度 80-360nm 不等，主要为 150 nm~300 nm，且短粒子较多。CWMV 为单链正义 RNA 病毒（ssRNA），包含两条基因组，分别命名为 RNA1 和 RNA2（图 1.1）。RNA1 大小为 7147 nt,含有 3 个开放阅读（OpenRead Frame, ORF）其中 ORF1 编码一个 153 kDa 的多肽，其 UGA 终止密码子能以一定比例通读(Read-through，RT)至 ORF2，产生一个含 RNA 聚合酶(RNA-dependentRNA polymerase，RdRp)，约为 212 kDa 的通读产物。ORF3 编码一个 37 kDa 的运动蛋白(movement protein，MP)[95]。CWMV RNA2 大小为 3569 nt，含有 3 个 ORF，ORF1编码一个 19 kDa 的外壳蛋白(Coat Protein，CP)，它的终止密码子 UGA 可部分通读开放阅读框，产生一个 84 kDa 的通读蛋白(CP-RT)；19 kDa CP 的起始密码子 AUG 之前的一个密码子 CUG，也可以作为起始密码子进行转录，产生一个约为 23 kDa 的蛋白质，与正常的 CP 蛋白相比，其 N 端多 40 个氨基酸，称为 N-CP。ORF3 编码一个富含半胱氨酸蛋白(Cystein rich protein,CRP)，约 19 kDa[95]。
图 2.1 TaeEF1β 重组质粒检测图.1 Identification of recombinant vector plasmids of Ta注：M：8000bp DNA Ladder；1：TaeEF1BNote:M:8000bp DNA Ladder；1:TaeEF1B源序列的分析eEF1B 基因的 ORF 区域氨基酸序列，用 BL(Oryza sativa，Os)、大麦 (Barley，Ba)、玉olor，Sb)、烟草 (Nicotiana benthamiana，N白，其在 NCBI 中的登录号分别为：XP_0151B)，NP_001149263.1(ZmeEF1B)，XP_002eEF1B)。利用 DNAMAN 软件将 TaeEF1B 与，比对结果显示这些不同物种间的 eEF1B .A）。用 smart 软件分析该蛋白的结构特征（模服务系统预测蛋白质的晶体结构（图 2.2.C7-226aa。
19图 3 (A)TaeEF1B 基因的二级结构；(B)保守结构域的预测；(C)蛋白质结构模型。Fig.3 (A) The secondary structure of TaeEF1B;(B)The conservative structural domain prediction; (C)The protein structure model of TaeEF1B.注：A： ；helix： ；strand； ：coli；B： ：（137-226aa）保守结构域Note:A： ；helix： ；strand； ：coli；B： ：The conservative structure domain of (137-226aa)
【参考文献】
本文编号：2881640
【学位单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S432.41
【部分图文】：
1.2.2 CWMV 病毒基因组结构CWMV 病毒粒子呈杆状，直径约为 20nm、长度 80-360nm 不等，主要为 150 nm~300 nm，且短粒子较多。CWMV 为单链正义 RNA 病毒（ssRNA），包含两条基因组，分别命名为 RNA1 和 RNA2（图 1.1）。RNA1 大小为 7147 nt,含有 3 个开放阅读（OpenRead Frame, ORF）其中 ORF1 编码一个 153 kDa 的多肽，其 UGA 终止密码子能以一定比例通读(Read-through，RT)至 ORF2，产生一个含 RNA 聚合酶(RNA-dependentRNA polymerase，RdRp)，约为 212 kDa 的通读产物。ORF3 编码一个 37 kDa 的运动蛋白(movement protein，MP)[95]。CWMV RNA2 大小为 3569 nt，含有 3 个 ORF，ORF1编码一个 19 kDa 的外壳蛋白(Coat Protein，CP)，它的终止密码子 UGA 可部分通读开放阅读框，产生一个 84 kDa 的通读蛋白(CP-RT)；19 kDa CP 的起始密码子 AUG 之前的一个密码子 CUG，也可以作为起始密码子进行转录，产生一个约为 23 kDa 的蛋白质，与正常的 CP 蛋白相比，其 N 端多 40 个氨基酸，称为 N-CP。ORF3 编码一个富含半胱氨酸蛋白(Cystein rich protein,CRP)，约 19 kDa[95]。
图 2.1 TaeEF1β 重组质粒检测图.1 Identification of recombinant vector plasmids of Ta注：M：8000bp DNA Ladder；1：TaeEF1BNote:M:8000bp DNA Ladder；1:TaeEF1B源序列的分析eEF1B 基因的 ORF 区域氨基酸序列，用 BL(Oryza sativa，Os)、大麦 (Barley，Ba)、玉olor，Sb)、烟草 (Nicotiana benthamiana，N白，其在 NCBI 中的登录号分别为：XP_0151B)，NP_001149263.1(ZmeEF1B)，XP_002eEF1B)。利用 DNAMAN 软件将 TaeEF1B 与，比对结果显示这些不同物种间的 eEF1B .A）。用 smart 软件分析该蛋白的结构特征（模服务系统预测蛋白质的晶体结构（图 2.2.C7-226aa。
19图 3 (A)TaeEF1B 基因的二级结构；(B)保守结构域的预测；(C)蛋白质结构模型。Fig.3 (A) The secondary structure of TaeEF1B;(B)The conservative structural domain prediction; (C)The protein structure model of TaeEF1B.注：A： ；helix： ；strand； ：coli；B： ：（137-226aa）保守结构域Note:A： ；helix： ；strand； ：coli；B： ：The conservative structure domain of (137-226aa)
【参考文献】
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本文编号：2881640
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