超敏肽核酸钳制PCR技术检测结直肠癌患者血浆PIK3CA基因突变

发布时间：2020-11-13 17:20

　　 研究背景:结直肠癌(Colorectal cancer CRC)是全球常见的消化道恶性肿瘤之一,近几年其发病率和死亡率呈上升趋势,已成为严重威胁我国人民健康的主要肿瘤之一。PIK3CA基因突变(phosphatidylinositol-4 5-bisphosphate 3-kinase,催化亚基α)已被证明与CRC的发生、发展和预后有相关性。然而,由于目前临床的检测方法灵敏度低,操作过程繁琐,使得PIK3CA基因突变的检测受到限制。方法:我们建立了一个超敏感的肽核酸钳制PCR技术(PNA-PCR技术)去检测血液游离DNA中PIK3CA基因在第9、20外显子发生的突变。而且,使用这种技术检测128位结直肠癌患者血液PIK3CA基因突变状态,与Sanger测序法对比,确定该技术的准确度。此外,随访了6名接受靶向治疗的CRC患者监测PIK3CA基因突变状态。结果:PNA-PCR技术的敏感度高,在检测第9和20外显子时分别为0.1%和0.2%。当128名结直肠癌患者的血液PIK3CA基因突变状态由PNA-PCR联合Sanger测序进行检测时,共有33名检测到E545K位点突变,29名检测到H1047R位点突变,这些病人中有13名是E545K和H1047R位点突变双阳性的,79位是两突变位点双阴性。总而言之,共有38.3%(49/128)的CRC患者发现E545K位点或H1047R位点至少一个位点存在突变。患者的临床参数,年龄(P=0.358),性别(P=0.622),疾病分期(P=0.353),疾病位置(P=0.307)及CEA状态(P=0.414)等都与PIK3CA基因突变状态没有相关性。在连续监测研究中,发现血液循环PIK3CA基因突变状况是可以预测EGFR单抗疗效的生物学标志物。因此,在CRC患者治疗过程中连续监测PIK3CA基因突变情况,能够指导患者正确的临床用药,使患者最大获益。当PIK3CA基因突变状态只由PNA-PCR方法确定时,ΔCp值与突变DNA占DNA总量比率之间有良好的线性关系。PNA-PCR与“金标准”测序相比,其准确性分别为93.75%和92.25%,当设定第9、20外显子ΔCp值的cut-off值分别为9.0和8.0时。结论:经过上述研究,开发了一种简单的、非侵入性的、超敏感的PNA-PCR技术,此技术尤其适用于含微量肿瘤DNA的血液样本检测。动态监测患者肿瘤基因突变状态是可以预测EGFR单抗疗效的生物学标志物。
【学位单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：R735.34
【文章目录】：
摘要
Abstract
主要符号表
第一章 绪论
第二章 材料和方法
    2.1 临床标本收集及处理
    2.2 材料与试剂
    2.3 实验方法
第三章 结果
    3.1 DLD-1、HCT116和A549细胞PI3KCA基因的突变分析
    3.2 PIK3CA基因E545K和H1047R位点突变的检测限度
    3.3 PNA-PCR联合Sanger测序法检测血液循环PI3KCA基因突变
    3.4 血液循环PIK3CA基因突变与结直肠病人临床参数的相关性
    3.5 PNA-PCR技术直接检测血液循环PIK3CA基因突变
第四章 讨论
第五章 结论
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢

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本文编号：2882432