番茄成花基因SFT上游调控因子SPL13和COL1的功能解析

发布时间：2020-11-13 21:43

　　 番茄(Solanum lycopersicum)是世界上栽培的重要蔬菜作物之一,同时也是研究花序及果实发育的重要模式植物,受到育种家们的广泛关注。高等植物中花序结构,开花数目,果实大小及品质和优良的植物株型与产量直接相关,对相关性状调控基因的解析对于理解表型变异的遗传基础,促进优良品种选育具有重要意义。番茄SINGLE-FLOWER TRUSS(SFT)基因是拟南芥开花相关基因FT的同源基因,该基因突变后直接影响花序结构及开花数目,因此研究该基因相关调控网络显得尤为重要。本实验室前期研究发现,番茄SPL13和COL1基因可以直接结合SFT基因的启动子而调控其表达,进而影响番茄植株花序的发育及产量,本课题对两个基因分别作了转基因功能分析,并进行了相关的分子遗传及生物学分析。1.高等植物的花序和侧枝都是由侧生分生组织分化形成的,花序结构对番茄果实产量有着直接的影响。前期本室已经证实miR156a通过抑制SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE(SPL)转录因子家族基因的表达,进而调控番茄花序结构和侧生组织的发育。对其下游的7个SPL靶基因进行转基因功能验证发现,在番茄中抑制SPL13基因的表达可以导致营养花序增多,花及果实的数目减少,果实变小,果实产量降低等系列表型,这些表型与过量表达miR156a表型相似,说明SPL13基因可能是miR156a下游的主效靶标基因。酵母单杂交、双分子荧光素酶、GUS表达、EMSA及ChIP-QPCR等研究结果及SFT在转基因材料中的遗传表达分析表明,SPL13蛋白通过直接与花序相关基因SFT的启动子结合而正向调控其表达,从而控制花序的发育。此外,研究还发现SPL13负调控番茄侧枝发育相关基因TEOSINTE BRANCHED1(TB1)和BARREN STALK1(BA1)的表达,在番茄中过表达TB1和BA1基因可以显著增加侧枝的数目。同时,免疫共沉淀(CoIP)试验验证了番茄侧枝发育相关蛋白Lateral suppressor(Ls)可以直接与SPL13蛋白互作,并抑制其在体内的活性,GUS表达试验进一步证明了Ls可以通过影响SPL13-TB1/BA1途径调控番茄的侧枝发育。综上所述,该研究结果为miR156a-SlSPLs调控番茄株型和产量的机制解析提供了依据。2.CONSTANS(CO)和CONSTANS-LIKE(COL)转录因子调控开花已在许多物种中被报道。本研究发现,在番茄中过量表达CONSTANS-LIKE 1(COL1)基因会降低番茄花及果实的数目、果实变小;抑制该基因表达果实变大、产量升高。酵母单杂交及GUS表达试验结果显示,与其他物种不同的是,番茄中的COL1可以不需要NFYB/NFYC的参与,通过直接结合启动子区的CCAAT顺式元件负调控SFT基因的表达,进而影响花序发育。同时,研究发现COL1正调控果实和叶片中叶绿素的含量,过量表达COL1基因会导致番茄果实和叶片叶绿素含量升高,果实在绿熟期叶绿素积累较多,为墨绿色;红熟期果实为深红色,抗坏血酸含量显著高于野生型;而抑制COL1基因的表达可以降低绿熟期果实叶绿素的含量,颜色变浅。Pull-down及免疫共沉淀(CoIP)实验结果表明,COL1可以直接与GOLDEN2-LIKE(GLK2)蛋白相互作用,促进GLK2的稳定性,从而调控番茄果实色泽形成。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S641.2
【部分图文】：

图 2-1 SPL13-RNAi和35S-miR156a转基因植株表型相似（A）定植 10 周后来自有代表性转基因番茄(左、中)和 WT(右)植株的第二个花序。（B）代表性转基因（左、中）和 WT（右）番茄植株的单株总产量。所有转基因株系均为 AilsaCraig 背景。（C-E） 花、果实的积累以及每株花序在三个发育阶段的营养枝的百分比。（F）转基因和 WT 番茄植株果实的纵横径的统计比较。（G,H）转基因和 WT 番茄植株在种植后 8 周第一花序下的节间数。（I，J）来自转基因或 WT 番茄植株的总果实产量和平均果实重量的值，选择三个转基因系的有代表性的四棵植株和四棵有代表性的 WT 植株中进行统计学分析，利用 t 检验对每组数据进行方差分析。统计学上的差异分为两组：*P < 0.05，**P < 0.01。Figure 2-1 Transgenic SPL13-RNAi and 35S-miR156a tomato plants are phenotypically similar.(A) Second inflorescence from representative transgenic (left and middle) and WT (right) tomato plants at 10 weeks afterplanting. (B) Total fruit yield per plant for representative transgenic (left and middle) and WT (right) tomato plants. Alltransgenic lines arein the Ailsa Craig background. (C-E) Accumulation of flowers, fruits and the percentage ofvegetativebranches per inflorescences per plant at three developmental stages. (F) Statistical comparison of the vertical andhorizontaldiametersofthefruits fromthe transgenicandWTtomato plants. (G, H) Lateral branchingnumber and numberof nodes under the first inflorescence in the transgenic and WT tomato plants at seven or eight weeks after planting. (I, J)Mean values for the total fruit yield and f

图 2-2 SPL13 CRISPR/Cas9转基因株系的侧枝及花序营养枝较野生型增加A）SPL13中设计的两个sgRNA目标位点（红色箭头）的示意图。黑色箭头表示用于PCR分析基因分型的引位置。（B）PCR扩增三个CR-spl13转基因T0代株系等位基因突变。Cas9基因的扩增显示转基因植株为阳性C）通过DNA测序分析验证T0代CR-spl13等位基因的突变，在三个转基因株系中发现，跨越两个sgRNA靶位置都存在一个长片段的缺失，红色字体表示sgRNA目标序列，黑色方框表示PAM序列。（D，E）SPLRISPR/Cas9 T0代转基因株系的侧枝和花序营养枝增多的表型，红色箭头表示叶腋产生的侧枝（D图），花序营养枝（E图），以WT（AC）作为对照。Figure 2-2 Increased vegetative branches from inflorescences and lateral branches in the SPL1CRISPR/Cas9 transgenic lines.A) Schematic illustration of the two sgRNA target sites (red arrows) designed in SPL13. Black arrows represent ocation of the primers that were used for PCR-based genotyping. (B) PCR-based analysis of three T0-generation Cpl13 mutant alleles with different amplicon lengths. Amplification of the Cas9 transgene is shown as a positive contC) Verification of the T0-generation CR-spl13 mutant alleles by DNA sequencing analysis. We found a long sequeeletion that spanned the two sgRNA target sites in all three lines. The red font indicates sgRNA target sequences. Tlack boxes indicate protospacer-adjacent motif (PAM) sequences. (D, E) Lateral branch and inflorescence vegetatranch phenotypes in the SPL13 CRISPR/Cas9 T0-generation lines. Red arrows indicate lateral branches

27图 2-3 spl13突变体中侧枝与果实数目观察统计-spl13番茄植株中叶腋（由红色箭头表示）产生的侧枝。（B）基于PCR扩增的三个CR-spl13等位CR-spl13和WT番茄植株的侧枝。（E，F）CR-spl13和WT番茄植株侧枝和果实数目的统计分组数据进行方差分析。统计学上的差异分为两组：*P < 0.05，**P < 0.01。e 2-3 Lateral branching and fruit number in the CR-spl13 lines without the PTXateral branching in the leaf axils (indicatedbyred arrows)in the CR-spl13 tomato plants. (B) PCR-baR-spl13 mutant alleles with different amplicon lengths. (C, D) Lateral branching in CR-spl13 and , F) Mean values for the lateral branching and total fruit number of the CR-spl13 and WT tomllysignificant differences between the mean values were evaluated using t-tests and are represented b, **P < 0.01.
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本文编号：2882686