番茄SlIPT4基因对叶片衰老和果实番茄红素合成的调控研究

发布时间：2020-11-13 21:39

　　 细胞分裂素(CKs)是一类重要的植物激素,在细胞分裂、顶端优势、叶片衰老、根的形成和生长、果实发育、以及适应逆境等多个方面发挥重要作用,但目前关于CKs在果实成熟方面的调控还未见报道。异戊烯基转移酶(isopentenyl transferase,IPT)是CKs合成的限速酶,催化CKs合成的第一步,不同的IPT基因可能调控不同的CKs合成。因此,研究IPT基因的生物学功能对揭示CKs的调控机制具有重要意义。番茄红素是一种重要的类胡萝卜素,在番茄果实成熟过程中大量积累,并赋予果实鲜艳的红色,是番茄果实成熟的重要特征之一。番茄红素合成和分解代谢过程受到很多因素的调控(包括植物激素),但是对其合成的具体调节机制还知之甚少。本研究分析了CKs合成基因SlIPT4在番茄中的表达特征以及其对不同激素处理和逆境胁迫的响应。同时,通过超表达和RNAi技术对其生物学功能进行了分析。主要研究结果如下:(1)利用RT-PCR技术对SlIPT4进行表达模式分析,结果表明,SlIPT4在嫩叶中具有较高的表达,随着叶片的成熟和衰老,其表达量逐渐降低;在坐果期的子房中(-2 dpa-4 dpa)SlIPT4大量积累,但在青熟期的果实中SlIPT4保持较低的表达水平,随着果实成熟SlIPT4表达量迅速增加,在破色期到红果期增速最为明显,表明SlIPT4可能在番茄叶片衰老、果实前期发育以及成熟过程中发挥重要调控作用。(2)SlIPT4对不同激素和逆境处理的响应分析表明:生长素(IAA)、乙烯合成前体ACC和乙烯合成抑制剂AgNO_3处理对SlIPT4的表达几乎无影响,而生长素抑制剂NPA处理增强SlIPT4基因的表达;脱落酸(ABA)能明显地抑制SlIPT4的表达;干旱胁迫、盐胁迫和水胁迫均能抑制SlIPT4的表达。这些结果表明,SlIPT4可能参与番茄非生物胁迫的适应过程,并受ABA调节。(3)构建SlIPT4的超表达和沉默载体,利用农杆菌介导的方法分别转化番茄子叶,获得SlIPT4超表达和沉默转基因株系。表型分析发现,SlIPT4超表达株系与野生型植株间的差异不明显,而SlIPT4沉默株系展现出明显的表型变化。(4)SlIPT4沉默导致番茄叶片加速衰老、叶片中叶绿素含量降低、叶绿素合成正调控基因GLK2表达下调、叶绿素降解正调控基因SGR表达上调、光合作用正调控基因Rbcs3A表达下调,表明SlIPT4可能通过调节番茄叶片中叶绿素的合成及代谢来调控叶片衰老过程。(5)SlIPT4沉默造成永不变红的橙色果实。色素测定表明,SlIPT4沉默株系的果实中总类胡萝卜素以及番茄红素含量均明显降低。定量PCR分析表明,SlIPT4沉默导致果实中类胡萝卜素合成基因ZISO和ZDS下调表达(ZISO下调最为明显,表达量仅为野生型的20%左右),其他番茄红素合成相关基因(PSY1,PDS,CRTISOs)均上调表达。这些结果表明,SlIPT4可能通过调控ZISO的表达来调控番茄红素的合成。(6)ABA是番茄红素主要的降解产物之一,在植物适应逆境过程中发挥重要作用。本研究发现沉默株系的番茄果实中ABA含量明显低于野生型番茄果实,暗示沉默株系果实中番茄红素的降低不是由于其降解过程增强,而是由于其合成受阻造成的。定量结果表明,ABA合成相关基因(ZEP、NCED1和NCED2)均上调表达,这一结果与类胡萝卜素合成途径中上游基因PSY1和PDS的上调表达相一致,验证了ABA与类胡萝卜素(番茄红素)合成之间负反馈调控方式的存在。综上所述,本研究明确了SlIPT4在番茄叶片衰老以及果实番茄红素生物合成调控网络中发挥重要的作用,对揭示CKs调控叶片衰老以及番茄红素合成的调控机制具有积极的意义。
【学位单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S641.2;Q943.2
【部分图文】：

图 1.1 细胞分裂素结构Figure 1.1 The structures of cytokinins① CKs 的生物学合成目前已知的 CKs 合成途径有两条：从头合成和 tRNA 降解途径（图 1.2）[6由于在大多数生物体内，CKs 通过与 tRNA 结合的方式存在，且降解途径释放的cZ 能经顺反异构酶转化为有活性的 tZ[7]，因此，曾一度认为 CKs 的合成是通过tRNA 降解途径实现。但最近的研究表明，cZ 和 tZ 之间的转换发生的频率很低，这与植物体内 CKs 的大量存在相矛盾。因此，目前普遍认为在植物 CKs 的合成中，从头合成是主要途径，tRNA 降解是次要途径[5]。CKs 的从头合成途径最初是在盘基网柄菌（Dictyostelium discoideu）中发现[8]。异戊烯基转移酶（isopentenyltransferase，IPT）是 CKs 从头合成途径的限速酶，催化二甲基丙烯基二磷酸（DMAPP）的异戊烯基转移到腺苷酸（AMP）的 N6位置上，生成异戊烯基腺苷磷酸。IPT 基因最先从根瘤农杆菌中（Agrobacteriutumefaciens）鉴定出来，命名为 tmr，tmr 基因突变导致植物根部产生类似根瘤的结

对 tZ 含量影响较小；干扰其他 7 个 IPT 基因的表达能显著的降低 tZ 及其衍水平，且在大肠杆菌中表达这 7 个基因能导致 iP 和玉米素的分泌[9]。另外， 35S 强启动子超表达 AtIPT4 和 AtIPT2 发现，导入 AtIPT4 的愈伤组织在无外胞分裂素的条件下仍能正常的分化，而导入 AtIPT2 的愈伤组织需外源施加细裂素才能诱导分化[11]。在高等植物体内，CKs 从头合成途径的主要初始产物是 iP 核苷酸，例如，异基腺苷 -5'- 三磷酸（iPRTP）和异戊烯基腺苷 -5'- 二磷酸（iPRDP），这是由 AMP、ATP 和 ADP 同时存在的情况下，植物 IPTs 优先利用 ATP 和 ADP[4]。苷酸可在细胞色素 P450 单加氧酶（CYP735A1 和 CYP735A2）的催化下转化Z 核苷酸[12]。iP 和 tZ 形式的核苷酸转变为具有生物活性、自由形态的 CKs 需过两步催化反应，但其对应的编码核苷酸酶和核苷酶的基因目前为止还未被出来。在水稻突变体的研究中发现，核苷酸形态的 CKs 可以通过 LONELYY（LOG）家族蛋白直接催化为有活性的游离态 CKs[13]。

图 1.3 细胞分裂素信号转导模式图[14]Figure 1.3 The model of cytokinin signal[14].1.2 类胡萝卜素的生物合成及调控类胡萝卜素是一类含有 40 个碳原子的类异戊二烯聚合物，可由所有的光合以及一些非光合作用的细菌和真菌合成[19]。类胡萝卜素往往具有特有的颜色（到红色范围），这是由于共轭双键的数目不同造成的，一般共轭双键的数目越多色越偏向红色[20]。在植物中，类胡萝卜素不仅行使色素功能，还在光合作用过程中发挥重要作收集（吸收 450-570 nm 的光能增强植物的光合作用）和光保护（使过量的光离叶绿体）[21, 22]。此外，类胡萝卜素还可以为植物激素（ABA、JA）的合成前体[23]。同时类胡萝卜素对人体具有很多益处，例如，抗氧化、延缓衰老、抗[24-26]。 类胡萝卜素的合成类胡萝卜素的合成是一系列复杂的酶促催化反应过程，目前其合成的分子
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本文编号：2882683