芒果果实类胡萝卜素相关基因挖掘及初步鉴定

发布时间：2020-11-14 22:52

　　 芒果是我国极具特色的热带水果,素有“热带果王”之美称。色泽是果实外观品质中的核心指标,其对果实的营养品质和经济价值具有重要作用。色素的积累是果实色泽形成的物质基础,色素的种类和含量决定了果实的色质和呈色深度。果实的呈色素主要包括叶绿素、类胡萝卜素、花青苷和黄酮类等物质。其中类胡萝卜素在芒果果实中的分布十分广泛,并随种类不同,呈现无色、浅黄色、黄色、橙色到红色不等,而其所含的主要类胡萝卜种类和含量尚不清楚,研究利用高效液相色谱法检测‘红玉’芒果和‘桂热82号’芒果2个品种成熟果实的果皮中的主要类胡萝卜种类和含量。以‘红玉’芒果为试验材料,开展转录组测序分析,筛选鉴定了部分与类胡萝卜素相关的基因片段,并以类萝卜素代谢为基础克隆了部分重要基因,开展了生物信息学分析,同时采用实时荧光定量技术进行初步鉴定,为阐明芒果果皮类胡萝卜素合成和调控机制奠定基础,本研究的研究结果如下:1、利用高效液相色谱法检测‘红玉’芒果和‘桂热82号’芒果2个品种成熟果实的果皮中的主要类胡萝卜种类和含量,以正己烷,二氯甲烷等多种有机溶剂提取果皮的类胡萝卜素,使用高效液相色谱法进行定性定量分析,结果表明‘红玉'芒果和‘桂热82号’芒果的成熟果实均积累叶黄素和β-胡萝卜素,而品种间的积累量存在差异,不同成熟阶段的积累量也存在差异。‘红玉’芒果在采后Oh阶段中含122.70 μg/g的β-胡萝卜素,是采后6个成熟时间段中的最高含量,叶黄素在采后Oh阶段的含量为最高,其含量为5.20μg/g,是其他阶段的1.7倍左右。‘桂热82号’芒果采后48h含量达到最大值,其含量为100.00 μg/g,叶黄素含量保持在3.30μg/g左右基本不变。2种芒果的叶黄素含量变化不大,并且β-胡萝卜素含量均高于叶黄素的含量,其中红玉芒果的β-胡萝卜素含量随着果实成熟和果皮变黄呈现下降趋势,但桂热82号’芒果的β-胡萝卜素含量则呈现小幅度上升,所以β-胡萝卜素的降解是芒果果皮从绿色变成黄色的原因之一,芒果中高积累β-胡萝卜素,为以后研究芒果积累β-胡萝卜素的分子机理提供理想的研究材料。2、选用‘红玉’芒果进行转录组测序,结果共获得原始数据6.80Gb,通过拼接获得了 58058个isogenes,共包含66965683 bp,平均长度为1153.43bp,共鉴定得到26871个Unigene。采用GO功能分类工具可将序列划分为3个大类55个亚类,共涉及到代谢过程、细胞过程、应激反应、生物调节等诸多生理生化过程。通过KEGG pathway分析,芒果果实转录组数据有27667个Unigene能注释到296类代谢途径中,包括维生素消化吸收、细胞受体信号途径代谢通路等代谢通路,共有45个Unigene注释到类胡萝卜素生物合成通路上,鉴定后获得32个类胡萝卜素合成相关基因。所以对芒果后熟过程的转录组进行研究,揭示了芒果后熟转录组的整体表达特征,获得了芒果转录组unigene序列和芒果后熟过程中有重要功能的基因序列。为深入研究芒果分子标记等研究提供数据资源。3、利用RT-PCR克隆7个与芒果合成类胡萝卜素相关的基因全长序列,并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术对以上7个基因进行表达分析。结果表明:LCYB、ZDS、CCD、PSY、PDS、BCH、VDE基因的 DNA 全长分别为:1693bp、1883bp、1900bp、1620bp、1822bp、1061bp、1446bp;ORF finder分别为:1506 bp、1710bp、1614bp、1299bp、1170bp、888bp、1446bp;氨基酸数量分别为:501个氨基酸、569个氨基酸、537个氨基酸、432个氨基酸、389个氨基酸、295个氨基酸、481个氨基酸。同源性比较表明芒果中的LCYB、ZDS、CCD、PSY、PDS、BCH、VDE编码的蛋白质在进化中各自都具有高度的保守性。氨基酸理化性质的分析显示LCYB、ZDS、CCD、PSY、PDS各自编码的蛋白中亮氨酸(Leu)的含量虽有差别但皆是含量最高的氨基酸,但VDE则是谷氨酸(Glu)的含量最高,而BCH是丙氨酸(Ala)的含量最高。氨基酸疏水性/亲水性的分析显示以上基因编码的蛋白都为亲水性蛋白。跨膜结构域预测与分析显示LCYB、ZDS、CCD、PSY、PDS、VDE肽链都位于膜外,皆不存在跨膜结构域,说明植物LCYB、ZDS、CCD、PSY、PDS、VDE蛋白在质体中完成了合成、翻译、加工成为成熟的蛋白质的整个过程,并没有出入细胞器,但是BCH蛋白存在4个跨膜结构域,1-90位的氨基酸位于膜内,91-295氨基酸之间形成4个典型的跨膜螺旋区,表明BCH蛋白可能是一个与细胞信号转导有关的膜受体蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,'桂热82号'芒果和‘红玉’芒果的6个时间段类胡萝卜素的合成限速酶PSY均是上调表达的现象,‘红玉’芒果PSY基因表达量都显著高于‘桂热82号’芒果,同时类胡萝卜素的合成途径的相关基因LCYB、ZDS、PDS、BCH、VDE初始状态也是呈现上调表达,之后有小幅度变化。因此,从‘红玉’芒果的果皮中克隆得到与类胡萝卜素合成相关的基因,这些基因可能参与调控芒果果皮类胡萝卜素合成从而影响果皮在后熟过程中的颜色变化,其中PSY基因与果皮从绿色变成黄色有很大的关系。
【学位单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S667.7
【部分图文】：

?Ｖｒｉａｌ？ｘ４Ｍｈｉ＜ｉ??ｃａｎｉｈａｆｉｘａｉｔｉｃｌｕｒｉ??图１」类胡萝卜素分子结构（李福枝，２００７）??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｃｏｍｍｏｎ?ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．??１．２类胡萝卜素的性质??类胡萝卜素是一类脂溶性色素和大分子量的化合物，因为其含有羟基、甲氧??基、环氧化、羰基、结构，所以极性较强，有较强亲脂性，几乎不溶解于水中，??易溶于有机溶剂如：石油醚、己烷、丙酮、三氯甲烷、乙醚等。但是随着含氧官??能团数量的增加，类胡萝卜素亲脂性的能力则减弱，反而在乙醇中的溶解度增强??（惠伯棣，２００５）。??在色素细胞中，类胡萝卜素这类脂溶性物质是膜蛋白不可或缺的一部分，类??胡萝卜素具有不稳定的分子结构，在遇氧、遇酸、强光照、高温下易降解变化或??异构化，故其在生物体中将与结合蛋白绑定在一起，以达到可以稳定其结构的目??的

海南大学硕士学位论文??２材料与方法??２．１材料??２．１．１实验材料??（１）红玉芒：后熟过程中，果皮由绿色逐渐转变成黄色??（２）桂热８２号：后熟过程中，果皮始终为绿色??本研宄所用试材均取自农业部儋州芒果种质资源圃，各取‘红玉’芒、‘桂热??８２号’芒１２个均匀一致的果，分成４组，３个果为一生物学重复，取果皮分装，??其中每个小包装果皮５ｇ左右，液氮速冻１０分钟，－８０度保存。间隔２４ｈ取样１??次，共取样６次，直至芒果完全后熟达到可食程度。???

图２．２红玉芒的６个阶段??Ｆｉｇ．?２．２?Ｔｈｅ?ｓｉｘ?ｓｔａｇｅｓ?ｏｆ?Ｈｏｎｇｙｕ?ｍａｎｇｏ．??２．１．２试剂及仪器设备??（１）菌株与载体??大肠杆菌感受态ＤＨ５ａ、克隆载体ｐＭＤ１９－ＴＶｅｃｔｏｒ均购自宝生物工程（大连）??有限公司。??（２）主要试剂??ＲＮＡ提取试剂盒：多糖多酚植物总ＲＮＡ提取试剂盒购自天根生物科技有限??公司。??反转录试剂盒购自?Ｔｈｅｒｍｏ?公司：ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ?Ｆｉｓｔ?ｓｔｒａｎｄ?ＣＤＮＡ?ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｋｉｔ，??目录号：Ｋ１６２２。??反转录试剂盒：ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ?ＲＴ?ｒｅａｇｅｎｔ?Ｋｉｔ?ｗｉｔｈ?ｇＤＮＡ?Ｅｒａｓｅｒ（Ｐｅｒｆｅｃｔ?Ｒｅａｌ??Ｔｉｍｅ），?ＴａＫａＲａ。??聚合酶购自Ｔａｋａｒａ公司：ＥｘＴａｑ，目录号：ＲＲ００１〇??
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本文编号：2884040