半滑舌鳎免疫相关基因IgT和pIgR的克隆及表达分析

发布时间：2020-11-15 21:28

　　 半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)主要生长在我国近海地区,是我国重要的海水经济繁育鱼类。由于其肉质鲜美滑嫩、营养价值高、生长速度快等特点而深受人们喜爱并且被广泛养殖。随着养殖数量的增多,病害的威胁也日趋严重,尤其是鳃、皮肤和肠道由哈维氏弧菌所引起的溃烂最为严重,给养殖业带来的严重的经济损失。同时,鱼类主要的生存环境是在水体中,其中皮肤、鳃、肠等一些由大面积黏膜包被的组织是病原体侵入鱼体时首先接触的部位,因此黏膜不仅具有简单的物理隔离作用,其局部黏膜的免疫防御作用对病原的侵入更加重要~([1])。由于鱼类的系统进化地位较低以及其自身具有的特性,鱼类自身的获得性免疫机制尚未完善,使得非特异性免疫在抵抗外来病原菌的过程中起到了比特异性免疫更重要的防御效用~([2])。因此,从分子免疫应答方面来探究半滑舌鳎自身的免疫相关基因变得尤为紧迫。IgT是一种与硬骨鱼类的IgM和IgD不同的新型的免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)基因,属于Ig超家族成员之一。本实验根据半滑舌鳎基因组数据库对半滑舌鳎的新型的免疫球蛋白IgT序列的预测,通过PCR扩增以及RACE方法得到了半滑舌鳎IgT基因cDNA全长2033 bp,开放阅读框(ORF)1794 bp,编码597个氨基酸,5’UTR为99 bp,3’UTR为140 bp。保守结构域分析显示半滑舌鳎IgT氨基酸包含一个信号肽,4个重链恒定结构域(heavy chain domain,CH)和一个跨膜结构域。经CH区2蛋白序列的同源比对和系统进化树的构建,结果发现半滑舌鳎IgT基因与牙鲆的IgT基因的进化关系最近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示:IgT基因在半滑舌鳎鳃中的相对表达水平最高,在粘液、肠、脾脏和肾脏中的相对表达水平依次减少,在肌肉中的相对表达最低;经哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染一定时间后,IgT基因在半滑舌鳎的6个免疫组织中都出现一定程度的上调趋势,其中皮肤和肝脏在12 h出现峰值,肾脏在24 h出现峰值,在鳃和脾脏在48 h出现峰值,而肠到96 h时一直处于上调状态;在挑选出半滑舌鳎的抗病家系和易感家系中不同组织IgT基因的qRT-PCR结果显示在抗病家系鱼的脾脏、肠、鳃和粘液中的IgT基因的相对表达水平均高于易感家系,而肾脏和肝脏中IgT的表达水平在抗病家系和易感家系间则没有明显差别。根据这些实验结果可以推测IgT基因在半滑舌鳎抵制外来病原菌的过程中起到了关键性的效用,并为鱼类无损伤抗病力的评价、挑选抗病相关基因标记、培养抗病良种和选育抗病家系提供了候选基因。多聚免疫球蛋白受体(polymeric immunoglobulin receptor,pIgR)是I型跨膜糖蛋白,属于Ig超家族的成员之一,以膜整合蛋白的形式作为多聚免疫球蛋白(pIgs)的介质,在黏膜上皮细胞内进行极性运转,在非特异性免疫与特异性免疫中均起到了重要效用~([3])。本实验通过半滑舌鳎基因组数据库中预测的pIgR序列,经过PCR扩增以及RACE法方得到了半滑舌鳎pIgR cDNA全长为1419 bp,ORF为1020bp,编码339个氨基酸,5’UTR区域为109 bp,3’UTR区域为290 bp。保守结构域初步分析结果显示半滑舌鳎的pIgR氨基酸序列含有一个信号肽、两个免疫球蛋白结构域(Ig-like domain,ILD)、一个跨膜结构域。通过蛋白同源比对和系统进化树分析,发现半滑舌鳎pIgR基因与大菱鲆和牙鲆的pIgR基因进化关系最近。经qRT-PCR实验分析,发现pIgR在健康的半滑舌鳎中的9种组织里都有所表达,且在鳃里pIgR相对表达水平最高,而在肌肉中相对表达最低。经哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染刺激后,pIgR基因在半滑舌鳎的5个组织(肝脏、脾脏、肾脏、肠和鳃)中都出现先增加后减少的规律,其中在脾和鳃中48 h出现峰值,在肝、肾和肠中72 h达到峰值。与内脏组织不同的是,pIgR基因在皮肤中呈一直上升的趋势。这些实验成果充分说明,pIgR在半滑舌鳎抵制哈维氏弧菌的反应过程中起到了主要的效用。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

上海海洋大学硕士学位论文干透；（8）根据提取出小白点的大小情况，加入适量 RNase-Free 的超纯水，将 RNA沉淀充分溶解；（9）用 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 质量，可看见 28S、18S 两个清楚的条带（图 2-1），表明提取的 RNA 结果良好可用于后续的实验，同时使用 GeneQuantPro RNA/DNA 分光光度计测定 RNA 浓度；将合格的 RNA 放在﹣80 ℃保存备用。

图 2-2 粘液 cDNA 的质量检测Fig.2-2 The detection of cDNA in Mucus2.3 半滑舌鳎 IgT 基因的克隆2.3.1 IgT 基因中间片段序列的验证根据 Chen 等完成的半滑舌鳎全基因组测序和转录组测序结果[15]，得到 IgT 的部分序列，设计了 2 对引物 IgT-F/R（表 2-1）验证序列的正确性。设计的引物序列由北京睿博兴科生物技术有限公司（青岛区）合成。表 2-1 实验所用引物及目的Tab.2-1 The sequences and usageof primers used in this study引物引物序列(5ˊ-3ˊ)片段大小

24图 2-4 半滑舌鳎 IgT 基因的 CH 区与其他物种 IgT的 CH 区多重序列比对结果Fig.2-4 The multiple sequence alignment of the IgT of CH in C.semilaevis with the IgT of CHin other species黑线表示的是形成链内二硫键的保守半胱氨酸(C)残基，保守色氨酸(W)残基在序列下方显示。形成与 Ig 轻链之间的链间二硫键放入保守半胱氨酸(C)残基用“↑”标记。The conserved cysteine (C) residues that form the intrachain disulfide bonds are marked withblacklines, and the conserved tryptophan (W) residues are shown below the sequences. Theconserved cysteine (C) residues that form the interchain disulfide bond with Ig L chain are markedby “↑”.
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 ;半滑舌鳎高雌苗种制种技术产业化推广项目通过专家现场验收[J];江西饲料;2019年01期

2 孙斌;孙金生;张丽娜;肖鹏;;半滑舌鳎肾脏组织结构与细胞种类研究[J];海洋科学;2017年04期

3 张伟;丁春林;;半滑舌鳎工厂化养殖技术探讨[J];河北渔业;2016年07期

4 李仲明;;半滑舌鳎育苗设施和关键技术[J];科学养鱼;2014年10期

5 李忠红;李耕;潘玉洲;郑文军;李爽;;北方地区半滑舌鳎池塘越冬技术初探[J];科学养鱼;2015年01期

6 苏兆军;;浅谈半滑舌鳎养殖中常见病害及防治技术[J];中国水产;2015年02期

7 黄亚冬;朱亚光;吴刚;;半滑舌鳎机体营养研究进展[J];科学养鱼;2015年03期

8 张伟;官曙光;刘梦侠;王其翔;周健;;半滑舌鳎养成技术及其生长速度与温度的关系[J];科学养鱼;2012年08期

9 潘元潮;陆波;;海水池塘混养半滑舌鳎试验[J];中国水产;2011年04期

10 宫春光;齐遵利;陈福杰;于清海;胡晓刚;;半滑舌鳎人工繁育技术要点[J];科学养鱼;2010年05期

相关博士学位论文 前10条

1 庄志猛;半滑舌鳎早期发育生物学与种质资源研究[D];中国海洋大学;2006年

2 邓思平;半滑舌鳎性别相关基因P450芳香化酶、FTZ-F1和DMRT1基因克隆及表达分析[D];中国海洋大学;2007年

3 邵长伟;半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）性别决定的基因组学研究[D];中国海洋大学;2012年

4 崔忠凯;半滑舌鳎基因组编辑TALEN技术的建立及雄性决定基因dmrt1的功能分析[D];上海海洋大学;2017年

5 周晓苏;许氏平鲉和半滑舌鳎促性腺激素释放激素（GnRH）基因的克隆和表达分析[D];中国海洋大学;2012年

6 李学鹏;半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）先天性免疫基因TLR2、TLR7、CD94和Bf的功能研究[D];中国科学院大学(中国科学院海洋研究所);2017年

7 董晓丽;半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）线粒体基因组全序列和性别相关基因的克隆与表达分析[D];中国海洋大学;2010年

8 姜黎明;半滑舌鳎遗传连锁图谱的构建及染色体定位的初步研究[D];中国海洋大学;2013年

9 宋文涛;半滑舌鳎、牙鲆微卫星遗传连锁图谱的构建[D];上海海洋大学;2012年

10 张正;养殖半滑舌鳎常见疾病的病理学观察与感染微生态分析[D];中国海洋大学;2012年

相关硕士学位论文 前10条

1 宋雪松;半滑舌鳎视黄酸受体克隆及其对无眼侧黑化的调控作用研究[D];上海海洋大学;2018年

2 王双艳;半滑舌鳎免疫相关基因IgT和pIgR的克隆及表达分析[D];上海海洋大学;2018年

3 王仁凯;半滑舌鳎性别大小异形的转录组学研究[D];上海海洋大学;2018年

4 甘甜;半滑舌鳎凝集素相关基因分子特性和表达分析[D];上海海洋大学;2018年

5 温丽联;半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)中性粒细胞胞外陷阱抗菌组分研究[D];中国科学院大学(中国科学院海洋研究所);2018年

6 郭林豪;半滑舌鳎miRNA前体预测及靶基因分析[D];河北大学;2018年

7 张金勇;孕酮受体膜组分1基因在半滑舌鳎生殖功能的研究[D];大连海洋大学;2016年

8 曹林;长链多不饱和脂肪酸在半滑舌鳎亲鱼及幼鱼中的营养作用研究[D];上海海洋大学;2017年

9 赵明丽;半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps）：产生特征以及抗菌作用[D];中国科学院大学(中国科学院海洋研究所);2017年

10 杨芳;半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）R-spondin2基因的分子克隆、表达模式及其在肌肉发育过程中功能的初步探究[D];中国海洋大学;2015年

本文编号：2885225