ERF转录因子亚家族基因在甜瓜果实发育中的功能

发布时间：2020-11-17 15:53

　　 甜瓜(Cucumis melo L.)是全世界广泛栽培的一种重要的经济类瓜果作物,贮藏性是甜瓜经济价值最重要的影响因素之一。乙烯在甜瓜果实成熟过程中发挥重要作用,而ERF又是乙烯信号转导途径中重要的转录因子,然而ERF在甜瓜果实发育过程中的功能仍然未知。本研究利用生物信息学方法分析了甜瓜ERF转录因子亚家族64个成员蛋白序列特性及其基因的启动子元件。以甜瓜品种河套蜜瓜为试材,使用实时定量PCR的方法构建了该亚家族成员在不同组织和不同发育时期果实中的表达谱,获得了 8个在果实发育中高表达的候选基因。利用瞬时表达的方法分析了候选基因的功能,进一步用候选基因的过表达、RNAi和基因编辑载体进行稳定遗传转化甜瓜,分析其在果实发育过程中的功能。主要结果如下:1.生物信息学分析发现甜瓜64个ERF蛋白的分子量介于14.00 kDa~46.62 kDa;40个蛋白的理论等电点小于7;预测所有蛋白均为亲水性蛋白;除CmERFIV-5,其他蛋白都是不稳定蛋白;58个蛋白定位于细胞核内、1个蛋白位于细胞质、5个蛋白定位于叶绿体;28个蛋白含有信号肽;64个基因获得83种启动子元件,其中包含赤霉素、茉莉酸、生长素、水杨酸、脱落酸和乙烯的不同应答元件,还包括厌氧、低温、热、干旱、创伤和真菌胁迫的不同应答元件;进化分析发现ERF在不同物种间相对保守;64个基因在12条染色上呈不均匀分布。2.实时定量PCR检测64个CmERFs在根、茎、叶,9 d、18 d、27 d、36 d、呼吸跃变期和跃变后期果实中的表达量,发现8个基因在呼吸跃变期高表达,且在跃变期和跃变后期的表达量存在显著差异,其中(CmERFⅠ-15、CmERⅡ-9、CmERFⅣ-2、CmERFⅣ-3在呼吸跃变后期的表达量显著高于根、茎、叶中的表达量。3.利用瞬时表达分析8个基因在果实发育中的功能,发现过表达CmERFⅠ-15、CmERFⅡ-9、CmERFⅢ-1、CmERFⅣ-2、CmERFⅣ-3、CmERFⅤ-4促进成熟,RNAi抑制其表达则延迟成熟;过表达CmERFI-18和CmERFⅢ-13延迟成熟,RNAi抑制其表达则促进成熟。4.选择瞬时表达效果最明显的五个基因:CmERFⅠ-CmERFⅡ-9、CmERFⅢ-1和CmERFⅣ-2CmERFⅣ-3构建基因编辑载体。将8个基因的过表达、RNAi载体和5个基因的基因编辑载体分别稳定遗传转化至甜瓜。分析T3转化果实成熟期,发现Cm2ERFⅠ-15的三个过表达株系分别比野生型早熟7.58天、7.47天和6.98天,RNAi三个株系分别比野生型晚熟9.20天、10.60天和11.08天,基因编辑三个株系分别比野生型晚熟13.23天、14.63天和14.53天;(CmERFⅡ-9的三个过表达株系分别比野生型早熟6.05天、6.35天和5.05天,RNAi三个株系分别比野生型晚熟8.15天、8.30天和9.10天,基因编辑三个株系分别比野生型晚熟11.80天、12.40天和12.75天。5.分别采摘CmERFⅠ-15授粉后28天的过表达果实、授粉后45天的RNAi果实和授粉后50天的基因编辑果实,采摘CmERFⅡ-9授粉后29天的过表达果、授粉后44天的RNAi果实和授粉后48天的基因编辑果实,测定上述果实采后的呼吸速率,发现CmERFⅠ-15和CmERFⅡ-9过表达果实分别在采后18.24小时和20.74小时出现呼吸峰值,分别比野生型提早7.16小时和4.66小时出现;两个基因的RNAi果实分别在采后31.81小时和31.65小时出现呼吸峰值,分别比野生型延迟6.54小时和6.25小时出现;两个基因的基因编辑果实分别在采后33.44小时和32.24小时出现呼吸峰值,分别比野生型延迟8.04小时和6.84小时出现。CmERFI-15和CmERFII-9的过表达果实采后硬度下降速度较野生型快,而RNAi和基因编辑果实的硬度下降速度较野生型慢。6.检测ACS和ACO在转基因果实中的表达量,发现CmACOI在CmERFI-15转基因果实呼吸跃变前期的表达量与野生型存在极显著差异,表现为CmERFI-15与CwACO1的表达量呈正相关;CmACO3在CmERFI-15和CmERFII-9转基因果实呼吸跃变前期和跃变期的表达量与野生型存在极显著差异,表现为CmERFI-15和CmERFII-9与CmACO3的表达量呈正相关;CmACS5在CmERFII-9转基因果实呼吸跃变期的表达量与野生型存在极显著差异,表现为CmERFII-9与CmACS5的表达量呈正相关。综上研究结果表明,甜瓜ERF转录因子基因CmERFI-15和CmERFII-9具有促进果实成熟的功能。
【学位单位】：内蒙古大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S652
【部分图文】：

合成途径被提出：Ｍｅｔ?经?Ｙａｎｇ－ｃｙｃｌｅ?形成?ＳＡＭ，ＳＡＭ?在?ＡＣＣ?合成酶（ＡＣＣ?ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ＡＣＳ）??作用下产生ＡＣＣ和ＭＴＡ，ＡＣＣ在ＡＣＣ氧化酶（ＡＣＣ?ｏｘｉｄａｓｅ，ＡＣＯ）作用下生成乙烯［１５］??（图１．１）。ＡＣＳ和ＡＣＯ是乙烯合成过程中的关键酶，甜瓜中已分离获得６个Ｕ基因，包??括？和其中属于诱导基因，在成熟的果实和种子中??检测到该基因的表达量较高［１６］；?和则在甜瓜果实发生呼吸跃变前表达［１７，１８］；??而在甜瓜果实成熟期高表达，但是该基因不受乙烯调控［１９］；?的功能仍属未??知；此外，还发现基因决定甜瓜花的性别分化本实验室利用花粉管通道法将反义??沿基因转入河套蜜瓜并获得耐贮藏甜瓜新品系［２１］。甜瓜中已克隆５个基因，其中??的表达受乙烯诱导，且随着果实成熟表达量显著增加，本实验室利用花粉管通道法??将反义〇以Ｃ０／基因转入河套蜜瓜，获得另一耐贮藏甜瓜新品系Ｐ２，２３Ｌ?和??在果实成熟过程中未检测到表达量［２４］。和则在果实成熟过程中差异表达

烯受体的活性［４７］；?ＲＴＥ１通过与ＥＴＲ１直接相互作用负调控乙烯反应［４８］；受乙烯调控的Ｆ－ｂｏｘ??蛋白ＥＴＰ１／ＥＴＰ２通过ＵＰＰ降解ＥＩＮ２［４９］；?ＥＩＮ３／ＥＩＬＳ还会受到ＪＡＺ等蛋白负调控［５°］。这些新??成员的发现，使得原本为线性模型的乙烯信号转导途径呈现出更为复杂的辐射状模型（图１．２）。??甜瓜中已分离获得乙烯信号转导途径中的多个元件。甜瓜乙烯受体基因０／＾７７？／和??已被克隆，并发现伴随果实的成熟，两个基因的表达量呈上升趋势［５１，５２］。姚远从甜??瓜中克隆得到基因，通过表达谱分析发现，该基因随着果实成熟表达量逐渐上升，??授粉后２０到３０天时表达量趋于稳定，４０天时开始缓慢下降［５３］。高峰从甜瓜中克隆得到??Ｏｗ－Ｅ／Ｚ八Ｏｗ－￡／Ｌ２两个基因，对其在果实发育过程中的表达量分析发现，两个基因在果实??成熟过程中的表达量逐渐上升，在授粉后３５天时表达量达到峰值，ＣＷ－Ｅ７Ｚ２在授粉??后４０天时表达量达到峰值［５４］。??５??

昼夜：８Ａ６ｈ）的３５日龄无菌苗，分别采集根、茎、叶和子叶，速冻于液氮中，用??于基因的表达分析。采摘授粉启９?ｄ、１８?ｄ、２７ｄ、３６ｄ的果实以及采后处于呼吸跃变期、跃变??后期的果实（见图２．１），取中果皮组织速冻于液氮中，用于基因克隆和表达分析。??ｒ?：：：才??图２．１不同发育时期的果实??Ａ：授粉后９?ｄ果实；Ｂ：授粉后１８?ｄ果实；Ｃ：授粉后２７?ｄ果实；Ｄ：授粉后３６?ｄ果实；Ｅ：呼吸跃期果??实；Ｆ：呼吸跃变后期果实??Ｆｉｇｕｒｅ２．１?Ｆｒｕｉｔｓ?ａｔ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ?ｓｔａｇｅｓ．??Ａ：?Ｆｒｕｉｔ?ａｔ?９?ＤＡＰ?（Ｄａｙ?ａｆｔｅｒ?ｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎ）；?Ｂ：?Ｆｒｕｉｔ?ａｔ?１８?ＤＡＰ；?Ｃ：?Ｆｒｕｉｔ?ａｔ?２７?ＤＡＰ；?Ｄ：?Ｆｒｕｉｔ?ａｔ?３６?ＤＡＰ；?Ｅ：?Ｆｒｕｉｔ?ａｔ??ｃｌｉｍａｃｔｅｒｉｃ；?Ｆ：?Ｒｒｕｉｔ?ａｔ?ｐｏｓｔ－ｃｌｉｍａｃｔｅｒｉｃ??１４??
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本文编号：2887677