假基因PDIA3P1在肝细胞肝癌中的表达及其功能机制研究

发布时间：2020-11-17 17:11

　　 肝癌是全球肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一,在我国肝癌也是肿瘤相关性死亡的重要因素之一,尽管在科研领域和临床上,科学家和医务人员都做了许多的努力,但是其导致的癌症相关性死亡率还是达到了第二位。这种现状主要是因为肝癌不易早期发现,而导致其往往不能被及时发现从而不能及时接受手术,错过最佳手术时机。而肝癌的术后复发转移则也是一个重要的原因。所以,找到新的肝癌分子标志物、探索肝癌发生发展的分子机制,开发新型的、特异性的肝癌治疗靶向药物对于肝癌的治疗至关重要。假基因是一种非编码基因,即一类结构上与编码基因类似的基因,但是假基因的结构中存在一些“缺陷”,导致他们不能编码蛋白。最初,假基因被认为是一种进化上基因突变而产生的无功能的基因“化石”。如今,越来越多的研究证明,假基因可以在DNA、RNA及蛋白多个水平发挥许多生物学功能,特别在肿瘤生理及病理过程中假基因也参与其中并起到了重要的作用。因此,众多假基因的发现,功能、机制的探索,为肝细胞肝癌的早期诊断与治疗预后提供了新的思路及方向。新型假基因PDIA3P1目前的研究尚处空白,本研究旨在探索假基因PDIA3P1在肝细胞肝癌发生发展中的作用及其机制。第一部分假基因PDIA3P1在肝细胞肝癌中的表达及其临床意义目的:研究假基因PDIA3P1在肝细胞肝癌中的表达及其临床意义。方法:通过RT-PCR验证假基因PDIA3P1在肝癌细胞系中的表达量;收集肝细胞肝癌病人组织,通过RT-PCR验证肝癌组织与癌旁组织中假基因PDIA3P1的表达情况。根据假基因PDIA3P1在临床标本中的表达情况,结合临床数据资料,做假基因PDIA3P1与临床资料相关性分析及预后生存分析。结果:在5种肝癌细胞系(Huh7、SK-Hep1、HepG2、HCCLM3 和 SMMC-7721)及一种正常肝细胞系(L02)中,假基因PDIA3P1在5种肝癌细胞系中表达较正常肝细胞系升高;90例肝癌病人组织中,假基因PDIA3P1在51对肝癌组织中高表达;假基因PDIA3P1表达量高低与肿瘤大小(p=0.005)、转移(p=0.027)和TNM分期(p=0.005)密切相关;高表达假基因PDIA3P1的病人预后较低表达预后差。结论:假基因PDIA3P1是潜在的促癌基因,可能参与肝细胞肝癌的发生发展过程,是一种潜在的新型的肝细胞肝癌标志物。第二部分假基因PDIA3P1对肝细胞肝癌增殖、凋亡及转移侵袭功能的影响目的:假基因在肿瘤中的作用正受到更广泛的关注,近年来通过对已发现的假基因的研究表明,假基因能够影响肿瘤的多种不同的生物学功能。本部分研究目的在于研究假基因PDIA3P1影响肝细胞肝癌生物学功能的作用。方法:利用小干扰RNA(siRNA)敲低SMMC-7721及HepG2肝癌细胞中表达,利用Transwell、EdU、cck8、流式细胞仪等实验方法检验其细胞功能学的改变;同时利用发卡RNA(shRNA)建立低表达假基因PDIA3P1稳转细胞系:SMMC-7721和HepG2细胞,进行克隆形成实验,检测肝癌细胞克隆集落形成能力,并建立裸鼠皮下成瘤及肿瘤转移模型,检测假基因PDIA3P1对肝癌细胞成瘤能力的影响。结果:敲低SMMC-7721及HepG2细胞中的假基因PDIA3P1后,细胞呈现增殖减慢、迁移能力、侵袭能力下降及凋亡增加的趋势;裸鼠皮下成瘤瘤体生长减缓。结论:假基因PDIA3P1是潜在的促癌基因,有促进肝癌细胞的增殖、转移侵袭,抑制凋亡的作用。第三部分假基因PDIA3P1影响肝癌细胞功能改变的机制目的:探究假基因调控肝癌细胞生物学功能改变的机制。方法:进行细胞爬片荧光原位杂交(FISH),检测假基因PDIA3P1在肝癌细胞中的定位;通过表达谱芯片探索PDIA3P1影响肝细胞肝癌功能学改变的机制。结果:细胞荧光原位杂交实验证实假基因PDIA3P1在细胞中大部分定位于细胞核中;表达谱芯片及Western Blot实验发现敲低假基因PDIA3P1后,p53通路蛋白cyclin E1发生了明显的降低,p53、p21、PERP、IGFBP3、发生了明显的升高。结论:假基因PDIA3P1通过p53通路调控肝细胞肝癌生物学功能的改变。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.7
【部分图文】：

胞、ＳＫ－Ｈｅｐｌ细胞、ＨｅｐＧ２细胞、ＨＣＣＬＭ３细胞和ＳＭＭＣ－７７２１细胞）以及一种??正常肝细胞株（Ｌ０２）中的表达情况，我们发现五种肝癌细胞株相对于正常肝细胞??表达明显升高（图１－１）。??氏?１５０］??１Ｊ?議??Ｉ』國＿??１Ｊ，?Ｂ?ｆｉ?Ｂ?■?１??①?ｕ?ＩＩ?｜?－?ｉ?ＩＩ??？ｖｖｖｙ??图１－１细胞株中ＲｅａｌＴｉｍｅ?ＰＣＲ检测假基因ＰＤＩＡ３Ｐ１的相对表达量??（以ＧＡＰＤＨ为内参）??３．２假基因ＰＤＩＡ３Ｐ１在肝细胞肝癌组织中高表达??为确定假基因ＰＤＩＡ３Ｐ１在姐织中的表达情况，我们通过ＲＴ－ＰＣＲ检测了本院??９０例肝细胞肝癌患者的组织，每例组织都有与其配对的正常癌旁俎织。我们发现，??１４??

第一部分假基因ＰＤＩＡ３ＰＩ在肝细胞肝癌中的表达及其临床意义??在９０例配对组织中有５６对组织中ＰＤＩＡ３Ｐ１的表达出现癌组织比癌旁组织表达量??升高的情况（图１－２），癌组织中假基因ＰＤＩＡ３Ｐ１的表达与癌旁组织中ＰＤＩＡ３Ｐ１??的表达对比发现，癌组织中ＰＤＩＡ３Ｐ１表达量明显高于癌旁组织（图１－３）。??ＰＤＩＡ３Ｐ１?ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ?ｉｎ?ｔｕｍｏｒ?（５６．７％）??ｃｏｍｐａｒｅ?ｔｏ?ｎｏｒｍａｌ?ｔｉｓｓｕｅ??〇?１－５－１??｜?１．０－?ｊ??－Ｑ?ｇＢｌｌｌｌＩｌ??￣?〇＿５＿??＾。＿。－画圓圓ｉ腳丨舖＿酬麵誦ＩＩ画圓画画??〇?－０．５－?ＩＰ??？?Ｉ＂??１－１．０」??图１－２?９０例组织中有５６例组织假基因ＰＤ丨Ａ３Ｐ１呈高表达??１５??

第一部分假基因ＰＤＩＡ３ＰＩ在肝细胞肝癌中的表达及其临床意义??在９０例配对组织中有５６对组织中ＰＤＩＡ３Ｐ１的表达出现癌组织比癌旁组织表达量??升高的情况（图１－２），癌组织中假基因ＰＤＩＡ３Ｐ１的表达与癌旁组织中ＰＤＩＡ３Ｐ１??的表达对比发现，癌组织中ＰＤＩＡ３Ｐ１表达量明显高于癌旁组织（图１－３）。??ＰＤＩＡ３Ｐ１?ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ?ｉｎ?ｔｕｍｏｒ?（５６．７％）??ｃｏｍｐａｒｅ?ｔｏ?ｎｏｒｍａｌ?ｔｉｓｓｕｅ??〇?１－５－１??｜?１．０－?ｊ??－Ｑ?ｇＢｌｌｌｌＩｌ??￣?〇＿５＿??＾。＿。－画圓圓ｉ腳丨舖＿酬麵誦ＩＩ画圓画画??〇?－０．５－?ＩＰ??？?Ｉ＂??１－１．０」??图１－２?９０例组织中有５６例组织假基因ＰＤ丨Ａ３Ｐ１呈高表达??１５??
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本文编号：2887738