野燕麦乙酰辅酶A羧化酶基因克隆，表达及突变点检测

发布时间：2020-11-17 20:13

　　 野燕麦是一种世界性恶性农田杂草,主要以化学防治为主,由于除草剂大量单一使用,已经产生严重的抗性。为了明确野燕麦对除草剂的抗性及其机理,本文采用整株测定法测定了24个野燕麦种群对精噁唑禾草灵的敏感度以及离体条件下测定其乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)对精噁唑禾草灵的敏感度,并进一步探讨了野燕麦相对抗性种群和敏感种群ACCase基因相对表达量差异以及ACCase氨基酸序列突变点检测。具体结果如下:1、通过整株测定法测定了24个野燕麦种群对精噁唑禾草灵的敏感度。结果表明,就茎而言,对精噁唑禾草灵最不敏感的野燕麦种群是西华(周口),其IC_(50)的值为643.790g.a.i/hm~2,襄县(许昌)是最敏感的种群,其IC_(50)值为4.23 g.a.i/hm~2,两者相差151.2倍;就根而言,武陟(焦作)是最不敏感的地区,其IC_(50)为2977.041 g.a.i/hm~2,鄢陵(许昌)是最敏感的地区,其IC_(50)为793.75 g.a.i/hm~2,两者相差2.75倍。虽然根与茎对精噁唑禾草灵的敏感度差异性很大,但均表明,野燕麦对精噁唑禾草灵产生了不同程度的抗性。2、离体条件下测定了24个野燕麦种群ACCase对精噁唑禾草灵的敏感度。结果表明,鹤山(鹤壁)地区的野燕麦种群ACCase对精噁唑禾草灵的敏感度最高,其IC_(50)为11.334 mg/L;社旗(南阳)地区野燕麦种群ACCase对精噁唑禾草灵的敏感度最低,其IC_(50)为17720.677mg/L。综合不同种群野燕麦对精噁唑禾草灵的敏感度来看,对精噁唑禾草灵敏感度低的野燕麦种群,其ACCase对精噁唑禾草灵的敏感度也都较低,反之亦然。这说明野燕麦对精噁唑禾草灵的抗性与ACCase关系密切。3、用IC_(10)(6.9 mg/L)的精噁唑禾草灵处理24小时后,采集样本并构建cDNA文库,然后通过转录组测序(RNA-Seq)筛选出差异表达的ACCase基因,最后利用实时荧光定量PCR对其中相似度最高的ACCase基因进行验证。结果共筛选出8个注释为乙酰辅酶A羧化酶的unigenes,其中有5个下调,3个上调。为了进一步明确ACCase与野燕麦对精噁唑禾草灵抗药性之间的关系。我们用精噁唑禾草灵分别处理社旗(Y21),西华(Y3),召陵(Y24)三个抗性种群和敏感种群鹤山(Y11),24 h后收集样本,通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析精噁唑禾草灵对其ACCase基因表达的影响。结果表明,3个抗性种群与一个敏感种群的ACCase基因的相对表达量均受到了精噁唑禾草灵的抑制,但抗性种群受到的抑制程度明显要小于敏感种群。这表明野燕麦对精噁唑禾草灵的抗性与ACCase基因的表达能力有关。将3个抗性种群ACCase基因相对表达量进行比较,我们发现ACCase基因相对表达量由高到低依次为社旗(Y21),西华(Y3),召陵(Y24),与ACCase对精噁唑禾草灵敏感度测定结果一致。4、为了验证野燕麦对精噁唑禾草灵的抗性是否由ACCase基因突变引起。我们将遂平(Y19),社旗(Y21),西华(Y3),召陵(Y24)4个相对抗性种群和鹤山(Y11),温县(Y7),舞阳(Y9),淮阳(Y16)4个相对敏感种群的ACCase基因进行克隆,然后与大穗看麦娘(Alopecurus myosuroides,GeneBank accession No.AJ310767)ACCase全长基因进行多序列比对。结果表明,所测地区野燕麦种群在已报道的ACCase氨基酸序列突变(Ile-1781-Leu,Trp-1999-Cys,Trp-2027-Cys,Ile-2041-Asn,Asp-2078-Gly,Cys-2088-Arg)处均没有发生点突变。这表明我们所测定的野燕种群对精噁唑禾草灵的抗药性不是由所报道的靶标位点突变引起的。
【学位单位】：河南科技学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S451
【部分图文】：

BCCP）亚基，生物素羧化酶（biotin carboxylase，BC）亚基和转羧酶（biotintranscarboxylase，CT）的α亚基（CTα）与β亚基 （CTβ）这四个亚基组成。BCCP 亚基和 BC 亚基为同型二聚体，CTα 和 CTβ为异型二聚体，两者以共价键相连，形成 CT 催化域。以上四个亚基结合在一起形成 ACCase 全酶，可能以（BC）2（BCCP）4（CTα, CTβ）2的形式存在[7]，但异质型的 ACCase 并不稳定，容易解离。同质型的 ACCase 为真核类型 ACCase[8]，它的一条多肽链含有异质型 ACCase 所有 4 个亚基，这四个亚基按照 BC、BCCP、CTβ、CTα的顺序排列，形成了 BC，BCCP 和 CT 三个功能域（CTβ 和 CTα 算一个功能域）（如图 1-1）[9-11]。相对于异质性 ACCase，在活性状态下的同质型 ACCase呈现结构稳定，不易解离的同型二聚体。所有生物体内同质型 ACCase 都具有相同的组织结构：NH2-BC-BCCP-CT-COOH。此外这两种 ACCase（ACCaseⅠ和 ACCaseⅡ）还存在两个特殊情况：第一就是在禾本科植物中，无论是质体还是胞质溶胶，它们的ACCase 类型都是同质型（如图 1-2）[12]；第二是油菜的叶绿体有可能同时含有 ACCaseⅠ和 ACCaseⅡ。

第一章 绪论类 ACCase 仅由α和β两个亚基组成，其中α亚基包含 BC 和 BCCP 两个功能域，β亚基包含 CT 功能域。第四类 ACCase 是在古细菌（Melallosphaera .sedula）研究中发现的，该类 ACCase 的结构与异质型 ACCase 较为相似，唯一不同的地方为 CT 功能域只由一个亚基组成[7]。

图 1-2 植物体内乙酰辅酶 A 羧化酶类型Fig 1-2 Structures of plant ACCase1.1.2 植物体内乙酰辅酶 A 羧化酶羧化酶的功能两种 ACCase 在植物体内脂肪酸合成中发挥的作用各不相同（如图 1-3），ACCaseⅡ首先是通过其 BC 域的催化和 ATP 的参与下发生羧化作用，使与蛋白结合的生物素辅基羧化，然后再在 CT 域的催化作用下将羧基从生物素转移到乙酰辅酶 A 羧化酶上，形成丙二酰辅酶 A，此丙二酰辅酶 A 用于脂肪酸的从头合成。ACCaseⅠ催化生成的丙二酰辅酶 A 则用于延伸脂肪酸链及合成与类黄酮有关的次生代谢产物[15-16]
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本文编号：2887868